表型組學在水稻研究中的應用

彭永彬 謝先芝

(山東省水稻研究所, 濟南 250100; *通信聯系人, E-mail: xzhxie2010@163.com)

水稻是世界主要糧食作物。面對全球環境多變和人口快速增長所帶來的一系列挑戰，如何在減少投入的前提下有效挖掘水稻高產優質的潛力，是亟待解決的問題[1]。因此，培育具有病蟲害抗性、養分利用率高、耐旱等特性的水稻成為解決問題的關鍵[2]。此外，水稻的基因組小，與其他禾本科作物的基因組具有共線性，因此水稻作為理想的單子葉模式作物，其重要農藝性狀的功能基因組研究是植物生物學研究的熱點。表型數據的獲取依靠人工篩選勞動量大、效率低，受人工主觀因素影響大。而且隨著勞動力成本逐年增高，表型檢測的成本逐年升高[3]。此外，某些表型數據的獲取只能以破壞水稻植株的完整性為代價，無法獲取植株生長發育的動態性變量。

表型組學是指在基因組水平上系統地研究某一生物或細胞在各種不同環境條件下所有表型的學科[4-5]。近十年來，隨著植物高通量表型無損獲取方法及數據獲取設備的發展，表型組學研究手段開始應用于植物基礎研究和作物育種中[6-8]。高通量表型分析平臺可用于篩選大型植物種群、鑒定種質資源、繪制遺傳圖譜、提高表型數據獲取的精準度且無損傷性，同時通過自動化、遠程操控及圖像數據分析，實現勞動力低投入[9]。當前，表型組學在水稻研究應用中，對單一或少數表型研究相對較多，從組學角度出發對水稻表型進行的研究較少[4]。

隨著測序技術的快速發展，水稻全基因組水平上的功能分析進入高通量時代[10]，如已深入解析了S5、GS5、SNAC1、RID1等調控重要農藝性狀的關鍵基因功能[9,11-14]。但由于表型分析工具的落后，限制了解析數量性狀遺傳學的能力。顯然高通量表型組學成為功能基因組學及作物育種研究的新瓶頸之一[4]。為此，植物表型組學研究，結合高通量表型分析平臺和基因組分析技術，必將成為植物基礎研究學者快速解碼大量未知基因功能的重要科學工具，對發現并揭示作物重要基因功能，加強和提升我國在作物功能基因組及作物遺傳改良領域的地位有非常重要的意義。本文從常用公共文獻數據庫中檢索已發表的關于水稻領域表型組學研究的文獻，對目前的研究現狀進行列舉綜述，旨在概括目前表型組學在水稻研究中的應用方向，為以后的相關研究提供理論基礎。

1 基于植被指數評估水稻產量

水稻育種方案中通常以株高、葉長、葉寬、葉角、穗型、分蘗數等冠層結構參數為主要選擇指標。冠層光合作用的改善對提高水稻生物量和產量具有重要意義[15,16]。如何快捷高效地獲取冠層結構參數是目前水稻冠層光合作用研究需要解決的問題之一。到目前為止，還沒有一種穩健的方法判定冠層輻射利用效率（radiation use efficiency, RUE）的最佳參數組合。3D冠層光合作用模型(threedimensional canopy photosynthesis model, 3dCAP)有效地結合了3D冠層結構、冠層垂直氮分布、光線追蹤算法和葉片光合作用[17,18]。Chang等[19]研發了一個高效的 3dCAP參數化工作流程，可以預測不同氣候條件下水稻不同氮肥處理的日冠層RUE。并且利用3dCAP，研究了分蘗數、分蘗角和葉角三種冠層結構參數對冠層 RUE的影響。該研究結果表明通過多種參數組合可以得到相似的冠層RUE。該新模型的研發為應用于改進型冠層 RUE的水稻模型設計工作奠定基礎。此外，Chang等[19]研究報道了一個整合了冠層三維結構、冠層垂直氮分布、光線追蹤算法和 C3葉片光合模型的三維株型與冠層光合模型 3dCAP模型，該模型具有一套參數化算法，從水稻植株、分蘗、穗及籽粒等方面高效采集模型輸入參數。同時，他們還設計了用戶操作系統，可實現冠層結構模擬、冠層光合模擬、植株株型優化、栽培密度優化等多種研究目的。

時間序列植被指數（time-series vegetation indices, VIs）通常用于糧食產量估算，該指數受到品種背景、光照及大氣條件等多種內外因素的影響，這影響了作物產量的評估準確性。利用遙感手段估測水稻產量，極大提高了工作效率，但其精度也受水稻生育期的影響。為此，Wang等[20]利用無人機搭載Rikola高光譜成像儀，獲得了分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期、灌漿期、成熟期等關鍵生育期的高光譜圖像和水稻產量，提出了基于地塊層次的相對植被指數（relative vegetation index）和相對產量，在水稻產量估算中，確定了不同生育階段的最佳植被指數型及其波段組合。該方法進一步豐富了基于遙感數據的水稻產量估算技術系統。為解決水稻不同生育期需要使用不同估測模型的問題，Jiang等[21]在水稻不同生育期分別獲取高光譜分辨率的多光譜影響和高地表分辨率的RGB（red-green-blue）圖像。利用運動恢復結構（structure from motion, SfM）算法，從 RGB影像中獲取水稻冠層的點云結構，然后構建不規則三角網（triangulated irregular network, TIN），利用TIN提取水稻冠層的幾何結構信息，將水稻田的積溫（growing degree days,GDD）作為氣候信息。之后分別對比光譜、幾何結構、光譜+幾何結構、光譜+幾何結構+氣候信息四種方法的估測精度。最后確定光譜+幾何結構+氣候信息的方法對生物量的估測精度最高。該研究提出了一種將光譜信息和水稻冠層幾何結構信息以及種植區域的氣候信息結合的生物量估測方法，提高了全生育期生物量估測精度。為了解決水稻生育后期稻穗的出現對遙感預測形成干擾而導致估測精度下降的問題，Duan等[22]提出了一種植被指數和混合像元分析相結合的方法，在水稻的孕穗期和抽穗期，分別獲取多光譜無人機影像以及地面實測數據。將得到的植被指數和水稻葉片、穗及種植土壤等豐度信息相結合，在兩個時期內分別建立基于無人機影像的植被指數與水稻產量之間的關系，研究表明該分析方法可明顯提高水稻抽穗期的估產精度。

2 基于水稻生長動態評估施氮量

水稻植被生長動態變化與施氮量密切相關。有效評估水稻不同生長時期的植被指數，對于種植早期診斷和施肥的定量調控具有重要意義。新興的高通量植物表型分析技術，使得人們對于水稻植被動態指數的掌握提升到新的層面。Zhu等[23]提出了一種利用水稻植株點云的端到端重建體系，根據水稻植株特性精確地分割不同類型的點云，采取表面和邊緣擬合以確保生成精準的平滑度，最后通過后處理得到真實的可視化效果。該研究所獲取的水稻點云有助于精準掌握水稻生長動態。為了快速準確判斷水稻種植密度與施氮量的相關性，Liu等[24]開發了一種基于數字圖像的水稻產量預測與評估的簡單模型。研究結果表明施氮量和種植密度對水稻產量有顯著影響。水稻產量隨著施氮量的增加先增后減，而隨種植密度的增加而增加。水稻冠層的歸一化紅光（normalized redness intensity, NRI）、綠光（normalized greenness intensity, NGI）及藍光（normalized blueness intensity, NBI）強度值主要受施氮量的影響，而與種植密度不存在顯著相關性。有效評估水稻種植指數對種植早期診斷和追肥的定量調控具有重要意義。Zhang等[25]選用三個典型的粳稻品種并施用不同量的氮肥設置不同組別，利用傳感器在水稻早期至中期多次收集光譜反射率數據，隨后根據數據計算最佳植被指數并建立動態模型和季節性糧食產量預測模型。最終分析表明歸一化差異紅邊指數（normalized difference red edge,NDRE）適用于水稻氮素營養分析，基于NDRE模型的特征平臺值準確預測了水稻種植條件與產量水平間的差異。該研究所構建的新動態模型有效地預測了水稻莖稈伸長和孕穗期籽粒產量，為水稻生產氮肥追肥管理提供了實時氮素營養數據。此外，對水稻冠層變量進行無損快速估算是精準施氮的有效措施。高光譜遙感可用于及時準確地分析冠層的理化性質。然而種植背景中的土壤和水等成分差異使得冠層光譜反射（canopy spectral reflectance,CSR）預測作物氮利用變得復雜。Din[26]等建立了動態冠層氮狀態指標、葉片干重、葉片氮濃度、葉片氮積累與冠層光譜反射衍生的新高光譜植被指數（hyperspectral vegetation indices）之間的定量關系，并分析了利用這些定量關系在不同水稻生長時期對碳氮變量進行評估的合理性。該研究為水稻生長期氮素施用的精確管理提供了一種快速、準確的冠層氮指數估算方法。

3 基于高通量表型組學和基因組學平臺鑒定QTL位點

基于光學成像和圖像分析技術，可自動化連續無損持續測量水稻表型，通過結合基因組學，可定位到引起水稻植株表型差異的基因位點。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）是水稻產區的主要害蟲之一，導致嚴重的水稻產量損失，且由此帶來農藥污染等一系列環境問題。確定新的穩定抗源對于有效治理稻縱卷葉螟具有重要意義。利用高通量表型和基因組學分析平臺進行稻縱卷葉螟抗性的表型×基因型×環境互作分析，發現在不同環境條件下，受損葉面積、損傷程度及葉片長度等均具有非常高的廣義遺傳力，主要歸因于基因型效應，相對來說葉片寬度遺傳力則較低，受環境影響較大。最后通過聯合分析篩選出適用于培育具有抗稻縱卷葉螟品種的兩種穩定基因型[27]。

由于缺乏適當的供體，以及缺乏高通量表型和基因型×環境相互作用的分析平臺，限制了水稻籽粒蛋白質含量（GPC）的主效 QTL的鑒定。Chattopadhyay等[28]使用籽粒蛋白供體 ARC10075和高產栽培品種Naveen開發了BC3F4定位群體，并采用40K Affimetrix自定義SNP陣列對190個品系進行基因分析，以鑒定影響蛋白質含量的穩定QTL。在三個已鑒定的QTL中，一個是關于水稻籽粒蛋白質含量（qGPC1.1）的，另兩個與在環境中穩定遺傳的單粒蛋白質含量(qSGPC2.1,qSGPC7.1)有關。作者在這些已鑒定的 QTL中，假設存在一些控制種子貯藏蛋白的功能基因，并在基于NIR光譜的BC3F5群體中利用qGPC1.1進行高通量表型驗證。隨著qGPC1.1在第1染色體短臂端粒區的滲入，高蛋白系中谷蛋白含量升高。這一點得到了編碼谷蛋白家族蛋白 QTL區域內候選基因的支持。冠層溫度可作為氣孔導度的良好指標。為了解普通和高產水稻品種間氣孔導度表型差異的遺傳基礎，Fukuda等[29]對冠層溫度進行了數量性狀基因位點分析，利用可見光圖像和熱圖像采集冠層溫差數據，定位到第11染色體短臂上穩定的QTL位點qCTd11。該研究結果表明qCTd11不僅參與調節冠層溫度，還影響氣孔導度和光合速率。

4 基于表型組學平臺分析水稻脅迫響應

水稻種植過程中易受洪澇、干旱、溫度、氣候、土壤鹽漬化等不同脅迫的諸多挑戰。利用表型組學手段深度剖析水稻脅迫響應表型差異，為培育優質高產且耐受性強的水稻品種提供技術支撐。

水稻的根系結構指其根系的空間構型，決定了其對營養吸收和水分利用的效率。由于不同品種水稻的根系結構具有豐富的多樣性，影響植物的生理功能并且與它們在環境中的適應性息息相關，因此當前研究迫切需要高精度量化根系結構以了解其與根功能之間的關系[30,31]。Han等[32]開發出一種用于水稻RSA 3D定量的成像系統，利用該系統對育成的 20個水稻品種幼苗的二維側視圖像捕獲，隨后從圖像中分離出根，最后構建水稻根系的3D圖像，并利用3D圖像量化表型性狀。該研究結果表明，20個品種的根形態和根的功能之間的確具有高度多樣性；隨著氣候日益惡化，可用淡水資源日益減少和高溫頻發，這些均嚴重影響水稻產量。CaineR等[33]研究發現，通過過表達水稻表皮形成因子OsEPF1，高產水稻品種IR64在產生較少氣孔的同時仍能保持較高的產量，這種低氣孔密度的水稻植株具有耐高溫和耐旱性；Dasa等[34]利用可見光、近紅外（VNIR）和短波紅外（SWIR）光譜對缺水脅迫下，水稻葉片的蔗糖、還原糖和總糖含量變化進行了模擬，通過高光譜數據分析不同脅迫水平下的蔗糖、還原糖和總糖含量，篩選出最佳植被指數和糖分檢測的最佳多元模型，快速無創監測水稻蔗糖、還原糖及總糖動態。傳統的耐旱性評估通常誤差較大且量化不足。為此，Duan等[35]利用表型組學手段在受控田間環境下動態量化作物干旱響應。首先對不同生長點的水稻單株的 RGB圖像進行分析，得出干旱響應特征，利用這些特征區分耐旱和干旱敏感材料，并在不同時間控制條件下量化動態干旱反應。該分析平臺可提供一個不依賴于人工的量化干旱反應工具，對未來育種和功能基因組學研究具有普遍的意義。有研究表明，在較高的CO2環境生長會導致水稻中的蛋白質、鐵和鋅含量都顯著下降。為了驗證該結論的準確性，Zhu等[36]通過表型組學技術手段在不同地區構建特定種植區，模擬未來50年的大氣CO2濃度，結果表明蛋白質、鋅和鐵的水平分別下降 10%、8%、5%，各類維生素含量也有所下降。盡管不同品種對高濃度CO2的響應區別很大，但整體而言，高濃度CO2對水稻品質帶來不利影響；Moura等[37]以表型和生理學手段鑒定具有優異耐冷性的水稻種質。用秈稻、粳稻及秈粳稻雜交材料探究水稻品種的遺傳多樣性和生態多樣性。通過生長溫度調節進行主成分分析，發現耐寒性較好的一些試驗品種。該研究有助于為水稻耐寒性品種的育種工作奠定基礎。本實驗室目前正利用表型組學技術研究水稻耐鹽性鑒定技術指標，探索了耐鹽性不同的水稻品種在鹽脅迫處理下苗期不同光合熒光參數變化，初步獲得了與水稻耐鹽性密切相關的熒光參數。在今后工作中，我們將利用該參數加快耐鹽水稻種質資源的篩選和耐鹽育種單株的選擇。

5 其他表型組學應用

葉氮含量（leaf nitrogen content）已被確定為決定光合能力的關鍵植物性狀。準確、快速、無損測量水稻劍葉氮含量對遺傳學家和育種工作者具有重要意義。Wang等[38]開發出一款具有三波段差比光譜指數的傳感器（R755、R513、R508），能夠實現無損實時測量水稻花期的葉氮含量，為表型組學在不同水稻品種的不同生長階段實現葉氮含量無損測量應用奠定了基礎。Qu等[39]研究了水稻葉片光合和生物量累積之間的關系，調查了來自中國和美國的大量水稻品系的4個表型性狀和14個光合作用參數，結果發現弱光下的光合作用速率與生物量累積顯著相關，且具有很高的遺傳效應。不同水稻品種間弱光下的光合作用速率差異顯著，該參數的挖掘有利于豐富現代水稻育種流程的測量指標體系。為提高水稻種子耐低氧的萌發能力，有效緩解由于播種后降雨量導致直播稻產量降低的狀況，Ghosal等[40]通過構建具有耐低氧萌發潛力的兩個遺傳圖譜，在不同環境條件下對水稻種子萌發情況進行表型分析，利用競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR, KASP)高通量SNP檢測技術進行基因分析，最終鑒定了水稻品系QTL的不同組合，后續用于進一步精細定位和調控機理研究。

6 展望

水稻基因組學研究為揭示水稻農藝性狀的生長規律提供了重要的理論基礎，但其中傳統高通量表型數據的獲取存在勞動量大，統計效率主觀偏差大等問題。高速發展的水稻基因組學研究同剛剛起步的水稻表型組學研究之間的矛盾，已成為制約水稻優質高產育種理論實現的瓶頸之一[41]。針對水稻的全表型數據分析會產生海量數據，目前的數據分析方法很難從這類數據集中提取出有意義的生物學信息。這需要開發更加精確、高效、處理性強的算法獲取更加可靠的數據；另一方面，需要表型組學與基因組學、轉錄組學等多組學相結合，將具體的表型性狀與相對應的遺傳信息聯系起來，量化分析水稻特定表型的遺傳規律，從不同角度多方位解析水稻重要發育過程。

從表型組學概念提出至今，外文文獻中以作物表型組學為主題的文獻有 288篇，中文文獻約 20篇[4]，隨著高通量作物表型獲取手段的不斷開發和完善，關于作物表型組學的研究越來越多，其中以水稻表型組學為主題的報道有 37篇，分別是關于逆境脅迫[27, 34, 35, 37, 42-46]、光合作用[33, 36, 39, 47]、農藝性狀[19, 20, 24, 29, 48-54]、氮肥管理[25, 26, 38]和種子活力[40]等的研究。

此外，在檢索到的288篇有關作物表型組學的研究中，關于表型組數據庫的研究僅 20余篇。目前植物表型組學數據庫有9個，但是針對水稻表型組學的完善數據庫尚未建立[4]。水稻表型組學作為一個快速發展的領域，新的表型獲取手段和研究方法不斷出現，只會催生越來越龐大復雜的水稻表型組數據。因此，構建特定水稻表型組標準數據庫，將成為日后的工作研究重點。