肺炎鏈球菌神經氨酸酶A的研究進展

殷庭萱，李藝然，劉志伊，徐 巖，賈文寧，劉金輝

(南昌大學a.瑪麗女王學院2017級； b.醫學院微生物學教研室，南昌 330006)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)是常見的呼吸道病原體，廣泛地存在于口腔或鼻咽部，約有5%～10%的健康成人和20%～40%的健康兒童攜帶此菌[1]。在人體中，S.pneumoniae感染所致疾病的種類與嚴重程度與其定植能力和侵襲部位有關，S.pneumoniae可以導致鼻竇炎、中耳炎和侵襲性肺炎。在特定的病理情況下，細菌可以侵入血液導致菌血癥，并最終穿透血腦屏障導致侵襲性腦膜炎。大多數感染和死亡病例見于機體免疫力較低的65歲以上老年人和5歲以下兒童[2]。采用S.pneumoniae感染動物模型進行的研究結果表明，其毒力因子神經氨酸酶A(neuraminidase A,NanA)參與S.pneumoniae的侵襲與擴散，在S.pneumoniae所致的多種侵襲性疾病中起重要作用[3]。本文對NanA在感染中的毒力機制進行簡要綜述。

1 肺炎鏈球菌毒力因子簡介

S.pneumoniae感染與多種毒力因子的表達有關，包括莢膜多糖、菌毛、S.pneumoniae溶素蛋白及多種蛋白酶類等分子。莢膜多糖不僅是細菌產生毒力的必需條件，幫助其抵抗宿主吞噬細胞的吞噬作用，有利于細菌在宿主體內大量繁殖，還具有抗原性，是S.pneumoniae分型的重要依據[4]。菌毛是S.pneumoniae胞外菌體結構之一，幫助細菌黏附到宿主細胞等各種固體物質的表面，提高細菌侵襲能力并參與生物膜形成。溶血素(pneumolysin,Ply)是細菌胞內蛋白，經自溶酶作用釋放后可以通過形成跨膜孔溶解真核細胞，并激活補體的經典途徑，刺激炎癥細胞因子產生，與S.pneumoniae感染導致的高死亡率及急性致死性肺炎和心肌損傷密切相關[5]。此外，S.pneumoniae表面蛋白(pneumococcal surface protein A,PspA)、S.pneumoniae表面黏附素A(pneumococcal surface adhensin A,PsaA)等表面蛋白也都被證實在S.pneumoniae致病過程中發揮重要作用。S.pneumoniae產生多種糖水解酶，通過對宿主細胞膜糖復合物的脫糖基化來促進細菌的黏附和定植，降解產物糖基還可作為細菌繁殖的營養物質。在這些糖水解酶中，神經氨酸酶致病性最強，具有降解唾液酸的酶活性，可以分解宿主細胞表面或體液中的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖復合物末端的唾液酸殘基。

2 神經氨酸酶分子結構特征

神經氨酸酶是S.pneumoniae表達的一種重要毒力因子，參與該菌致病過程。S.pneumoniae的基因組可編碼3種同源神經氨酸酶：NanA、NanB和NanC，三者在臨床分離株的基因頻率分別是100%、97%和36%～51%[6]，蛋白分子量依次為114、77、82 kD[2]。三者之中NanA活性最強，活性中心保守性最高，且在所有S.pneumoniae感染的臨床分離株中廣泛表達，說明S.pneumoniae的感染與NanA的毒力機制密切相關。NanA的編碼基因長約3108 bp，其蛋白產物約含1035 aa，可分為N端信號肽(aa1-120)、N端凝集素域(aa121-305)、催化域(aa326-437、aa532-822)、C端膜結合域(aa823-1035)等多個結構域[7]。各個結構域的功能不同，凝集素域又稱為碳水化合物結合組件(carbohydrate-binding module,CBM40)，可特異性識別聚糖末端唾液酸(sialic acids)，并引導NanA酶活性關鍵基團催化域與之結合。這一區域已被證實在細菌對人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells,hBMECs)的黏附和侵襲方面起重要作用，因此其可能是誘發細菌性腦膜炎的關鍵因子[8]。

NanA蛋白催化域呈現神經氨酸酶家族經典的六葉β螺旋槳樣折疊結構，活性中心含有對底物唾液酸進行化學轉化至關重要的氨基酸殘基，并包含一段功能未知的插入域(insertion domain)。C端膜結合域包含一段LPETG基序(motif)，其在S.pneumoniae轉肽酶A(sortase A,SrtA)作用下將NanA錨定在細胞壁表面，而NanB和NanC因缺失該序列而直接分泌到胞外，進入機體組織液[9]。

在NanB和NanC蛋白結構中，凝集素域和催化域在多種域間相互作用下形成堅硬球狀體直接相連，而在NanA中2個結構域彼此分離，由一段長度為16 aa的靈活連接體隔開，因而具有良好的柔韌性[10]。NanA具有廣泛的底物作用范圍，可大量識別、分解α-2,3鍵連接的唾液酸、α-2,6鍵連接的唾液酸和α-2,8鍵連接的唾液酸等3種底物，而NanB和NanC主要分解α-2,3鍵連接的唾液酸[2]。此外，生物信息學分析顯示NanA蛋白表面以負性電荷為主，活性中心則以正性電荷為主，這種特殊的電荷分布也能增強其對呼吸道上皮細胞的黏附和對天然底物唾液酸的特異性結合能力[11]。

3 NanA致病機制

3.1 促進細菌黏附與定植

唾液酸也稱乙?；窠洶彼?N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)，是一種細胞保護因子，廣泛分布于宿主胞膜表面，具有多種重要的細胞生物學功能。成功定植于呼吸道黏膜上皮細胞是S.pneumoniae的感染過程的第一步，而NanA對唾液酸的切割降解是幫助S.pneumoniae定植的重要分子機制。因為宿主上皮細胞表面所含的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖復合物末端多為唾液酸殘基。尤其是唾液酸化的糖蛋白如黏蛋白(mucins)在呼吸道黏膜表面表達水平較高，在黏膜表面形成了高粘稠度的粘液屏障。NanA對這些表面分子的唾液酸殘基裂解破壞了它們所形成的粘液分子屏障，使細菌得以定植上皮細胞，進而繁殖擴散到更深層的組織部位[12]。

S.pneumoniae對真核細胞的黏附過程分為兩步，首先與宿主細胞表面糖復合物進行較松散的相互作用，后與細菌侵襲相關的宿主受體進行更緊密、特異性更高的結合。NanA在第一步發揮作用：當細菌跨過粘液素屏障接觸到上皮細胞后，NanA裂解宿主細胞表面寡糖，暴露出下方的隱性受體，增強細菌對組織的黏附。NanA缺失的S.pneumoniae變異株在體外與在南美栗鼠氣管組織結合的能力較野生型下降，在體內經鼻感染后誘發下呼吸道感染的能力也減弱[13]。

感染組織后，S.pneumoniae需要通過糖類發酵代謝產生的能量來維持活性。盡管呼吸道表面的游離糖濃度有限，S.pneumoniae可以利用包括神經氨酸酶在內的一系列糖苷酶對宿主糖基化分子的水解作用來滿足其營養需求。其中，裂解并移除末端唾液酸是細菌對宿主糖復合物進行連續降解的第一步也是必要的一步，因此神經氨酸酶被認為是S.pneumoniae最關鍵的糖水解酶[14]。此外，經酶作用釋放的游離唾液酸在體內外均可作為擴散信號，促進S.pneumoniae在體內轉移、繁殖，并可以誘導細菌經鼻嗅球侵襲中樞神經系統引發非血源性腦膜炎[15]。

3.2 促進生物膜形成

生物膜是一種包裹在細胞外基質中的細菌的表面附著群落，形成生物膜是S.pneumoniae在上皮組織定植與生存的重要過程之一，在鼻竇炎患者的鼻中隔活檢標本上、實驗感染小鼠的鼻中隔上皮以及體外培養的呼吸上皮細胞上，都能夠檢測到S.pneumoniae生物膜的存在[16]。當S.pneumoniae在生物膜環境中生長時，NanA表達水平上調提示其在生物膜形成過程中發揮重要作用[17]，其作用主要是促進細菌微菌落的形成，及以微菌落為基本單位形成成熟的生物膜。而NanA缺失的S.pneumoniae菌株形成生物膜能力顯著下降[18]。PARKER等[19]的實驗結果顯示，高濃度的乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid,NANA)通過與底物競爭拮抗NanA活性，最終導致S.pneumoniae生物膜形成量顯著下降。這些研究表明NanA在S.pneumoniae生物膜的形成過程起重要作用。

NanA促進S.pneumoniae生物膜形成的機制是復雜的，目前認為其作用可能與酶活性有關，一方面通過降解宿主細胞表面糖基復合物，使游離唾液酸大量釋放促進生物膜形成[20]，另一方面通過暴露下層半乳糖殘基調節S.pneumoniae對碳源的攝取和利用促進生物膜形成[18]。WREN等[21]通過實驗證實NanA在生物膜形成過程中也發揮著與酶活性無關的獨特作用。生物膜給予細菌群體共享有利遺傳信息的機會，使之對抗菌肽具有更高的抵抗力，使得S.pneumoniae從最初的無癥狀定植逐步演化為具有誘發侵襲性疾病的潛能。

3.3 在S.pneumoniae侵襲性感染中的作用

NanA參與S.pneumoniae所致的死亡率普遍較高的侵襲性疾病(invasive pneumococcal disease,IPD)發生與進展過程，如敗血癥、腦膜炎和非典型溶血性尿毒綜合征(pneumococcal hemolytic uremic syndrome,pHUS)。S.pneumoniae通過多種途徑進入血流，包括淋巴管途徑、上皮細胞和內皮細胞的細胞損傷途徑以及內皮細胞的直接侵襲途徑。進入血液后，NanA通過對人體血清成分的脫糖基化來干擾補體因子C3在細菌表面的沉積[2]，減少中性粒細胞介導的調理吞噬作用，有利于細菌逃避機體免疫防御而在血液中繁殖擴散。另一方面，NanA從細胞膜復合糖結構中去除唾液酸將減少補體調節因子H與自身細胞表面的結合[22]。H因子作為補體激活途徑之替代途徑中的關鍵調節因子，抑制補體反應激活因子C3b在生物表面的沉積，保護自身細胞不受攻膜復合體(membrane attack complex,MAC)的破壞。因此，當H因子與紅細胞、內皮細胞以及血小板上唾液酸的相互作用減少時，缺乏調節的補體系統被激活可能導致全血溶血和血小板聚集，造成嚴重的系統性疾病。此外，NanA對某些關鍵免疫因子的脫糖基化作用將削弱其在免疫反應抵御病原體侵襲中的調控能力，有利于S.pneumoniae在體內生存繁殖。

血源細菌沿血管進入腦部，附著并穿透以單層hBMECs為主的血腦屏障，是腦膜炎發生機制中的首要過程。NanA缺失型S.pneumoniae對hBMECs的黏附、侵襲的能力較野生型下降約90%[23]，表明NanA在引發腦膜炎中發揮關鍵作用，細菌穿透血腦屏障后對神經系統造成的損害則與其它毒力因子協同完成。在內皮細胞上，NanA裂解末端唾液酸，修飾宿主細胞表面糖復合物以暴露親和力更高的受體，促進細菌粘附并穿透內皮細胞。此外，NanA蛋白N端凝集素結構域能夠充分活化內皮細胞，激活趨化因子[如interleukin 8(IL-8)]和中性粒細胞募集，在促進S.pneumoniae對hBMECs的侵襲以及誘發急性腦膜炎的過程中發揮重要且特異的作用[24]。

3.4 在與流感病毒協同感染中的作用

流感爆發或流行期間，肺炎發病率與死亡率過高被認為與S.pneumoniae和流感病毒之間的致死性協同感染有關。研究發現S.pneumoniae的NanA蛋白可以促進流感病毒從宿主細胞表面釋放，并在呼吸道組織快速擴散[25]。NanA促流感病毒擴散作用呈濃度依賴性：一定濃度下，可以增強流感病毒的復制能力；大量存在時，病毒的擴散能力和產量反而下降[26]。過量NanA可能通過裂解宿主細胞表面乳糖分子末端唾液酸(SA-α2,3-Gal和SA-α2,6-Gal)，清除病毒受體，干擾病毒對宿主的黏附[27]。

同時表達Nan和S.pneumoniae的NanA是流感病毒和S.pneumoniae2種病原體達到完全協同所必需的。共感染的流感病毒促進S.pneumoniae在鼻腔定植并加重疾病進展這一作用已被證實。為研究S.pneumoniae的NanA在共感染中的致病作用，WREN等[21]采用小鼠模型進行研究，鼻腔定植力與感染力均出現嚴重受損的S.pneumoniae的NanA缺失突變株在與表達神經氨酸酶的甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)共感染時，S.pneumoniae突變株的定植力與致病力均得以提升，但仍達不到野生S pneumonia的致病水平[21]，即流感病毒的神經氨酸酶不能完全彌補S.pneumoniae缺失的NanA的致病作用，說明2種神經氨酸酶分子的致病機制存在某些未知的差異，它們在2種病原共感染過程中起協同作用，從而加重S.pneumoniae疾病進展。

4 靶向NanA的藥物與疫苗的研制

S.pneumoniae作為引發社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)最主要的病原體，相關藥物與疫苗的開發一直是研制重點。隨著抗生素耐藥與人口老齡化的加劇，S.pneumoniae對一些抗生素表現多重耐藥，包括青霉素、大環內酯類、喹諾酮類及頭孢菌素類，且耐藥率逐年上升[27]。有效的S.pneumoniae疫苗很大程度上緩解了耐藥危機，現行使用的疫苗以莢膜多糖疫苗(capsular polysaccharide vaccine,PPV)(PPV23)和蛋白質-莢膜多價結合疫苗(protein-capsule multivalent conjugate vaccine，PVC)(PCV7、PCV10、PCV13)為主。多價結合疫苗將莢膜和蛋白載體相結合，激發T細胞參與免疫反應，從而產生更強的免疫原性和持久的免疫保護，顯著降低兒童(尤其2歲以下)S.pneumoniae肺炎發病率[28]。但由于細菌持續變異和選擇作用，其型別限制和莢膜血清轉換等缺點逐漸展現，“第三代疫苗”重組蛋白疫苗因其保守性好、免疫原性強、價格相對低廉等優勢得到廣泛關注[29]。

相比于傳統的血清接種，黏膜免疫是一種很有潛力的新型接種方式，可同時誘導黏膜和全身免疫反應，對主要定植于人類呼吸道黏膜表面的S.pneumoniae引發的肺部疾病提供更特異的保護[30]。有實驗[31]證實，用NanA蛋白黏膜免疫小鼠后可誘導高滴度抗體的產生，能有效抵抗致病性S.pneumoniae的感染，抑制其在宿主鼻咽部和肺部的定植，提示NanA或可作為新型疫苗的載體或融合蛋白，具有疫苗研發價值。

以S.pneumoniae的NanA蛋白毒力因子為靶點的新型藥物也在不斷研制中。從植物中提取的小分子藥物β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(β-Sitosterol-3-O-glucopyranoside，SOG)可以通過抑制SrtA酶活性阻止NanA在細胞壁上錨定[9]，進而影響NanA在促進細菌于呼吸道上皮黏附和定植中的作用，緩解肺組織病理變化。由于流感病毒神經氨酸酶和NanA結構存在一定的相似性，多種雙靶向該相似結構的神經氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitors,NAIs)也在研究與評估之中，這些藥物分子通過靶向抑制2種病原體之間的神經氨酸酶的協同作用，降低流感流行期間死亡率和S.pneumoniae二次感染發生率，目前研究發現桂木黃酮(Artocarpin)效果最優，是目前唯一對S.pneumoniae生長和生物膜形成都有抑制作用的NAI[25]。

5 結語

NanA作為S.pneumoniae的一種重要毒力因子，在S.pneumoniae的毒力及疫苗研發方面都起著重要作用。一方面，該蛋白主要在細菌致病的起始階段發揮作用，以多樣化的作用機制參與S.pneumoniae在人體不同部位的感染。另一方面，以NanA為靶點的抗S.pneumoniae藥物和新型疫苗的研制為減輕S.pneumoniae感染帶來的公共衛生壓力提供了新的途徑。雖然NanA毒力性質的認識已取得了一定的研究成果，但某些作用機制的結論處于實驗模型動物階段，并且模型動物與人體在組織結構功能上存在較大差異，加之NanA的氨基酸序列和抗原性在不同型別的S.pneumoniae中存在一定變異，因此研究成果最終轉化為臨床應用仍需進一步仔細驗證。