動脈粥樣硬化中PCSK9的致炎作用

李永林，尚莎莎，顧問，關懷敏，王賀，孟中華，司春嬰，柴爽爽，陳玉善*

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院 心血管內科，河南 鄭州)

0 引言

動脈粥樣硬化一直都是困擾人們的常見疾病，最近大家發現了一個抗動脈粥樣硬化的新靶點——前蛋白轉化酶subtilisin/kexin type 9 (PCSK9)。PCSK9是近年來大家研究的重點，他可以降解低密度脂蛋白膽固醇受體(LDL-R)，使低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平提高，從而增加了動脈粥樣硬化(AS)的風險[1]。這種發現使人們激發了研究PCSK9的興趣，近兩年的研究顯示，PCSK9可能不止這一個作用，其中一個作用似乎是促進動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的炎癥作用。脂質代謝失調會誘導炎癥和免疫反應，導致動脈粥樣硬化，而炎癥又可以反過來影響脂質代謝[2]。慢性炎癥現已漸漸被認為是AS的長期影響因素，而這種炎癥反應似乎又可以被PCSK9調節，近年來有很多文章顯示，PCSK9不僅可以調節肝細胞中的LDL-R，還可以調節巨噬細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞、血管內皮細胞等多種細胞的LDL-R代謝，而LDL-C的濃度升高，不僅會促進泡沫細胞的形成，還會導致炎癥反應的慢性放大，而炎癥反應卻又是血管破裂和血栓形成的主要原因，這一作用既促進了AS的形成，又增加了AS并發癥產生的風險[3]。故本文將對PCSK9與動脈粥樣硬化的的致炎作用進行綜述。

1 PCSK9誘導巨噬細胞的致炎作用

動脈粥樣硬化性斑塊中，巨噬細胞釋放炎癥因子誘導中膜平滑肌細胞(SMCs)增殖、遷移，導致并加速動脈粥樣硬化的形成。同時，研究發現，動脈粥樣硬化斑塊中的平滑肌細胞可表達和釋放PCSK9，加速斑塊內的炎癥反應[4]。有學者發現在健康受試者的人群中，血漿PCSK9水平和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平呈正相關，這一觀察結果也支持PCSK9在炎癥中的有促進作用[5]。

Chiara R等學者在近期做了一系列實驗來驗證PCSK9誘導巨噬細胞的致炎效應的假設：不同濃度(0.250-2.5μg/mL)的人重組PCSK9 (hPCSK9)處理THP1巨噬細胞和人原代巨噬細胞，2.5μg/mL PCSK9作用24小時后，兩種細胞均可明顯誘導IL-1β、IL-6、CXCL 2、TNF-α和MCP1mRNA的表達。THP-1巨噬細胞與高表達hPCSK9的HepG2mRNA共培養后，與HepG2相比，HepG2 PCSK9條件培養液可顯著誘導致炎基因TNF-α和IL-1β的表達，分別為HepG2的2.4±0.5倍和8.6±1.8倍。與野生型骨髓巨噬細胞相比，隨著hPCSK9濃度的增加，骨髓基質細胞LDLR+/+孵育可顯著誘導LDLR mRNA的表達，而LDLR-/-則相對較少，hPCSK9對小鼠骨髓巨噬細胞TNF-α基因表達的影響顯著降低(LDLR-/-和LDLR+/+分別為(4.3±1.6)倍和(31.1±6.1)倍)。健康成人(男533例，女537例)血漿PCSK9與腫瘤壞死因子-α水平呈正相關(B=8.7395%CI7.54×9.93，P＜0.001)[6]。

該實驗為了確定PCSK9的致炎作用，使用了LDL-R缺失小鼠的巨噬細胞進行對照，從上訴實驗結果可以看出，PCSK9對TNF-α有明顯的誘導作用。根據這一證據，可以設想LDL-C和PCSK9通過與LDL-R相互作用，來激活相似的細胞內信號通路，從而誘導巨噬細胞的致炎效應。之前也有學者發現PCSK9的致炎作用可能依賴于JAK和SREBP通路的激活，與這一觀點相似[7]。該實驗還提到PCSK9靶向的其他受體，如CD3629、VLDLR、LRP-130或ApoER231等，均可以參與致炎反應。他們認為PCSK9可能與致炎因子共同作用，誘導了動脈粥樣硬化中單核細胞募集相關的細胞趨化因子，比如：MCP-1和CXCL2，這一觀點也在別的研究中被證實[8]。從而可以大膽推測PCSK9通過募集動脈粥樣硬化斑塊中的循環單核細胞和中性粒細胞來促進局部炎癥反應。同年，在另一篇文獻中我們也發現，PCSK9抑制劑tocilizumab的AUC(藥時曲線下面積，表示藥物的生物利用度)的反應與白細胞(r=0.77，P＜0.001)和中性粒細胞(r=0.72，P=0.001)的AUC密切相關[9]。這證明了PCSK9確實與白細胞和中性粒細胞有關系，但是其通過哪些通路，有哪些介質，我們還知之甚少，感興趣的可深入研究。

2 PCSK9對于動脈粥樣硬化的局部致炎作用

眾所周知，PCSK9可通過調節LDL-R的數量來影響動LDL-C的血漿濃度，從而影響動脈粥樣硬化的產生，目前有證據證明PCSK9不僅可以影響LDL-R，還可以通過調節LRP1(一種LDL-R)，介導其在血管中的致炎作用，PCSK9可以誘導LRP1的缺失，而LRP1的缺失則會誘導炎癥的發生[10]。目前學者們發現PCSK9還可以不依賴膽固醇系統的改變來影響動脈粥樣硬化的炎癥反應。

實驗選用了apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠，將hPCSK9tg/apoE-/-小鼠的骨髓細胞和apoE-/-骨髓細胞移植到apoE-/-受體中，結果發現apoE-/-→apoE-/-和hPCSK9tg/apoE-/-→apoE-/-小鼠的血清膽固醇對比為861±73mg/dl vs 881±52mg/dl，和甘油三酯水平對比1431±36mg/dl vs 1441±26mg/dl無明顯差異。hPCSK9的局部積累引起病變組成發生了顯著變化，與對照組相比，hPCSK9tg炎癥性Ly6Chi陽性細胞顯著增加32%(分別為7.4±1.5%和5.6±1.1%)，具有統計學意義。這些結果表明，局部斑塊中的PCSK9可以不依賴血清或主動脈中膽固醇調節相關而促進炎癥單核細胞浸潤。接下來他們又研究了hPCSK9tg/apoE-/-小鼠體內的變化是否依賴于LDLR的存在，因為LDLR是PCSK9作用的共同靶點。hPCSK9tg/LDLR-/-和LDLR-/-小鼠的骨髓細胞移植到hPCSK9tg/LDLR-/-受體體內，高脂飼養8周后，甘油三 酯(859±141mg/dlhPCSK9tg/LDLR-/-)vs(1013±123mg/dl LDLR-/-)，兩組小鼠的血清膽固醇水平和病變斑塊大小均沒有顯著變化，炎癥性Ly6Chi陽性細胞(5.9±0.9% LDLR-/-)vs(5.9±0.8% hPCSK9tg/LDLR-/-)，綜合以上數據說明，PCSK9促進炎癥的作用是LDR依賴性的[11]。

為了研究PCSK9在動脈粥樣硬化中的局部作用，將相同背景的hPCSK9tg小鼠(分別為apoE-/-和LDLR-/-)的骨髓移植給apoE-/-和LDLR-/-小鼠。盡管血脂水平與病變斑塊的大小沒有明顯變化，但顯示病變中致炎單核細胞的LDLR依賴性增加，巨噬細胞hPCSK9以LDLR依賴的方式顯著改變致炎和抗炎細胞因子的表達。根據文章中可以推斷，即使在脂質濃度沒有變化的情況下，hPCSK9可以通過改變斑塊的形態，增加炎性Ly6chi單核細胞向巨噬細胞分化并促進它的浸潤，從而直接促進了動脈粥樣硬化的形成[11]。由于PCSK9在組織中的蓄積過于依賴LDL-R的作用，所以阻斷這一路徑對抗動脈粥樣硬化有明顯效果，但是這并不能排除通過其他路徑的直接致炎作用，比如上文提到的LRP1介導的機制[12]。

總而言之，PCSK9的局部致炎作用可以不依賴于血脂水平的變化，但是較為依賴LDL-R這一途徑，這就提示我們，對抗PCSK9的療法并不僅是降脂這一個作用，是從多方面降低動脈粥樣硬化的發生與發展。

3 PCSK9依賴血脂濃度的致炎作用

上文講到了PCSK9的局部致炎作用，是依賴于LDL-R基礎上的作用，而PCSK9還可以依賴于血脂濃度達到致炎作用，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是一種強效的動脈粥樣硬化致炎介質，它和其他致炎介質，如脂多糖，可誘導巨噬細胞、內皮細胞(ECs)、血管平滑肌細胞(SMCs)和樹突狀細胞表達PCSK9，而巨噬細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞和樹突狀細胞均在動脈粥樣硬化的演變中起關鍵作用[13]。

hPCSK9被發現能直接激活人類巨噬細胞、巨噬細胞遷移和釋放致炎細胞因子等。Liu等人發現在ox-LDL誘導的樹突狀細胞成熟和激活血液和動脈粥樣硬化斑塊中的T細胞中PCSK9扮演著一個重要的角色[14]。學者們又發現，在健康者和膿毒癥患者中，使用LPS處理后，PCSK9基因功能缺失與細胞因子反應減弱有關。同時，與野生型小鼠相比，PCSK9基因功能缺失的小鼠血清IL-1蛋白水平顯著降低[15]。此外，還發現當加入hPCSK9后可增強致炎細胞因子TNF-α和IL-1的轉錄，抑制Lps刺激巨噬細胞抗炎細胞因子的mRNA水平[16]。這些在體外以及動物和人類心血管疾病模型中的觀察結果，有力地支持了PCSK9本身增強了炎癥狀態，致炎環境又增強PCSK9表達和釋放的觀點。

LOX-1是內皮細胞上OX-LDL的主要清道夫受體，在巨噬細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞中也有表達，尤其是當這些細胞暴露于OX-LDL、血管緊張素II或致炎細胞因子時。值得注意的是，LOX-1在生長的斑塊和容易破裂的斑塊中也高度表達[17]。現在也有很多人認為，PCSK9的活化是巨噬細胞攝取LDL以及膽固醇轉運逆轉的原因。Ding等人證明重組的PCSK9促進了多種SRs(清道夫受體)的表達，例如LOX-1、SRA和CD36，其中LOX-1是上調度最大的SR，而這些SRs則是巨噬細胞攝取ox-LDL，啟動動脈粥樣硬化的重要介質[18]。

而盡管以上數據喜人，但是最近學者們發現盡管使用了高強度他汀類藥物和PCSK9抑制劑聯合治療，還是不能完全解決動脈粥樣硬化血栓形成的炎癥機制[19]，有學者用高敏C反應蛋白(hsCRP)來進行了關于PCSK9導致炎癥的測量，Pradhan根據患者用藥14周后的hsCRP和LDL的濃度水平，來評估9738名參加SPIRE-1和SPIRE-2心血管轉歸試驗的患者殘留的炎癥風險，這些患者同時接受了他汀類藥物和bococizumab治療， 在14周后，數據顯示盡管極大地降低了LDL-C，但是接受治療的患者繼續顯示循環hs-CRP水平持續升高，這也是心血管風險的重要預測因素[20]。學者們還發現在FOURIER試驗中，hs-CRP的水平與PCSK9抑制劑降低心血管不良結局的療效之間也同樣缺乏相關性[21]。

這些觀察表明，要么hs-CRP測量的炎癥沒有改變，要么hs-CRP只是炎癥的一個非特異性標志物，可能不能反映炎癥的全部譜系。但是有學者發現在冠狀動脈粥樣硬化患者中，炎癥標志物與血漿中PCSK9之間有很強的相關性[22]。

4 總結

PCSK9在動脈粥樣硬化中的致炎作用，是引起且導致動脈粥樣硬化的關鍵因素，但是PCSK9的作用在很大程度上依賴于LDLR。有證據表明PCSK9在清道夫受體表達、oxLDL攝取、泡沫細胞形成和新生內膜增生中均可以起作用。清道夫受體如LOX-1和PCSK9之間的正反饋循環導致mtROS的產生，加強細胞損傷，最終導致細胞死亡[23,24]。因此，針對PCSK9的靶向治療，可能與其他炎癥介質的抑制劑聯用，可以提供有效的治療選擇，以減輕ASCVD負擔，而不是單純利用降低LDL-C的作用來抗動脈粥樣硬化。而最近剛完成臨床三期實驗的Inclisiran，一種干擾PCSK9mRNA表達的siRNA，不僅具有降低LDL-C的作用，還具有抗炎、抗血栓、降lp(a)等眾多作用，是siRNA治療常見疾病的里程碑式的進程，同時也是治療動脈粥樣硬化的新起之秀[25]。但是目前這個藥還未大量投入臨床使用，也提醒我們可以從PCSK9的炎癥作用方面作更深入的研究，從PCSK9被發現到現在17年左右，脂質方面的內容已經被大家熟悉，我們是否可以換一種思路呢，抗炎作用，抗LP(a)作用、以及對清道夫受體的影響，都是值得我們去更多研究的思路。