microRNA Let-7對急性缺血性卒中的作用

耿路，廖慧玲

(西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州)

0 引言

急性缺血性卒中是指多種原因?qū)е履X的供血?jiǎng)用}狹窄甚至閉塞，使得局部腦組織血供突然減少或停止，腦組織缺血、缺氧致組織壞死或軟化的急性腦血管疾病，是臨床上常見病及多發(fā)病，常伴有不同程度的神經(jīng)功能缺損，具有較高發(fā)病率、死亡率及致殘率，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1-2]。目前其治療手段主要有溶栓、抗凝、減輕氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)功能康復(fù)訓(xùn)練等[3-4]。與常見心血管疾病不同，急性腦梗死主要通過臨床癥狀及影像學(xué)資料等作出臨床診斷，缺乏快速有效的臨床診斷血清學(xué)指標(biāo)及治療手段。因此，尋找更為精準(zhǔn)、便捷、高效的診斷工具及新的治療方法對提高急性缺血性卒中患者生存率及改善預(yù)后具有重要意義。微小RNA(microRNA ，miRNA)是一類單鏈的小分子非編碼RNA，約含有17～25個(gè)核苷酸，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平后基因的翻譯[5]。miRNA作為一種重要的基因水平調(diào)控因子，近年來在缺血性腦卒中深入研究中表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。let-7家族是人體內(nèi)最先被發(fā)現(xiàn)的miRNA，目前研究已較為成熟。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，目前發(fā)現(xiàn)的let-7家族約有13個(gè)亞型[6]，在人體內(nèi)異常表達(dá)與人類疾病如癌癥和心腦血管疾病密切相關(guān)。在不同腦組織let-7表達(dá)有所差異，研究證實(shí)[7]let-7家族在大腦海馬區(qū)高度表達(dá)表現(xiàn)出明顯的組織特異性，這可能是海馬區(qū)缺血易感性的原因之一。既往研究發(fā)現(xiàn)let-7在腦血管疾病診斷、治療及發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，本文通過查閱近五年let-7與腦梗塞關(guān)系相關(guān)文獻(xiàn)，對let-7在腦缺血中作用進(jìn)行綜述，以便尋找新的診斷、治療手段及治療靶點(diǎn)。

1 腦缺血中Let-7的作用

急性缺血性卒中病理生理過程復(fù)雜，其中涉及級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng)以炎癥及細(xì)胞凋亡相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)為主。目前認(rèn)為其病理損傷機(jī)制主要是炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)元凋亡及血管新生過程中多種通路復(fù)雜交互的作用。在此過程中多種蛋白差異性表達(dá)，參與級(jí)聯(lián)損傷機(jī)制，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)miRNA能與40%-50%哺乳動(dòng)物的mRNA結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控而影響mRNA翻譯編碼蛋白。因此miRNA可能參與整個(gè)腦缺血發(fā)生過程中。許多研究已證實(shí)let-7對腦缺血有明確作用。

1.1 Let-7與炎性損傷

大量研究結(jié)果證實(shí)炎癥反應(yīng)貫穿整個(gè)卒中發(fā)生發(fā)展過程，炎性因子的釋放影響繼發(fā)性腦損傷及恢復(fù)的過程[8]。白介素-6(IL-6)作為中樞性炎癥反應(yīng)早期的重要調(diào)控分子，在腦組織缺血缺氧后超量釋放的活性氧刺激下表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步激活炎性細(xì)胞因子，招募更多炎癥細(xì)胞聚集浸潤，損傷腦組織。其具體分子機(jī)制可能是IL-6靶向調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)iNOS的表達(dá)，增加NO生成，加重大腦氧化應(yīng)激損傷[9]。此外IL-6可激活其下游分子STAT3，刺激ROS產(chǎn)生，進(jìn)一步增加IL-6的產(chǎn)生加快局灶性腦缺血的梗死進(jìn)程，加重缺血再灌注損傷。有學(xué)者[10]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)Let-7f在無出血性轉(zhuǎn)化(HT)的急性腦梗死患者中的水平降低，且抑制IL-6的表達(dá)，說明Let-7f可抑制IL-6的表達(dá)而減輕急性腦梗死患者炎癥。此外，在該項(xiàng)研究中腦梗塞合并HT患者的Let-7f表達(dá)水平明顯增加，這提示Let-7f可能對HT發(fā)揮某種作用，然而其具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

有研究表明let-7a在腦缺血再灌注后腦組織中表達(dá)顯著上調(diào)，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元[11]。胡國章等[12]結(jié)合生物信息學(xué)方法，通過敲除小鼠let-7a表達(dá)發(fā)現(xiàn)let-7a靶向結(jié)合絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1 (MKP1)抑制其轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6等的釋放，減輕腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中廣泛存在的巨噬細(xì)胞，在腦缺血過程中發(fā)揮免疫監(jiān)控及加重?fù)p傷神經(jīng)元的作用[13]，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷反應(yīng)迅速激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)大量炎性介質(zhì)(如iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6等)表達(dá)，超量釋放NO和活性氧等有害物質(zhì)，不可逆的損害神經(jīng)元及周圍神經(jīng)細(xì)胞[14]。故抑制腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞激活不失為一種保護(hù)缺血腦神經(jīng)損傷新的治療方法。倪敬書等[15]通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究表明let-7c在中風(fēng)患者及腦缺血再灌注小鼠血漿中表達(dá)降低，過表達(dá)let-7c可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而抑制腦缺血后炎性反應(yīng)，減輕腦缺血神經(jīng)元損傷及改善缺血后神經(jīng)功能缺陷。

巨噬細(xì)胞在人體的功能集中于全身炎癥的誘導(dǎo)、消退及組織修復(fù)[16]，對腦缺血組織病理損傷及預(yù)后恢復(fù)具有重要意義。有研究證明let-7c 可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化緩解慢性炎癥[17]。巨噬細(xì)胞的極化機(jī)制復(fù)雜，受多種信號(hào)分子及其通路的調(diào)控，在不同環(huán)境的刺激下巨噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和替代性活化巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)，兩者功能幾乎相互拮抗[18]。Banerjee等[19]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)let-7c顯著促進(jìn) M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，抑制M1表型基因的表達(dá)，減少多種炎癥因子如iNOS，TNF-α和IL-6等釋放，從而減輕炎性反應(yīng)。

CD86由活化的單核細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)中風(fēng)后白細(xì)胞增殖與募集，刺激多種炎性介質(zhì)如IL -6，TNF-α，CCL2，TNFSF11等的產(chǎn)生，加重腦損傷。白細(xì)胞介素-8(CXCL8，IL-8)是由活化的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子，其調(diào)控可能是限制缺血性腦損傷必不可少的。能夠結(jié)合CXCR1和CXCR2來促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化性，增加MMP9釋放，促進(jìn)腦組織損傷，加重腦梗塞程度。HMGB1由腦細(xì)胞及包括白細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生，主要介導(dǎo)損傷組織先天免疫和修復(fù)，促進(jìn)白細(xì)胞增殖和趨化至損傷部位，與免疫炎性反應(yīng)密切相關(guān)。Jickling等[20]通過研究急性缺血性中風(fēng)患者let-7i調(diào)控白細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)let-7i負(fù)調(diào)控CD86從而抑制中風(fēng)后炎癥細(xì)胞活化及炎性因子釋放，減少梗死面積，減輕腦損傷并改善行為預(yù)后。Let-7i可能會(huì)增加IL-8，促進(jìn)與中風(fēng)嚴(yán)重性相關(guān)的嗜中性粒細(xì)胞活化，損傷腦組織，加重腦梗死程度。Let-7i減少可能使缺血性中風(fēng)患者的HMGB1增加，中性粒細(xì)胞增生，誘導(dǎo)MMP9釋放，進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)。因此let-7i通過靶向調(diào)控CD86，CXCL8和HMGB1這三種途徑調(diào)節(jié)中風(fēng)后炎癥反應(yīng)。

之前已證實(shí)Toll樣受體4(TLR4)參與急性缺血性卒中炎癥病理機(jī)制，有大量的研究報(bào)道let-7i通過靶向調(diào)控其下游分子TLR4基因及蛋白表達(dá)參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制。向偉等[21]在建立缺氧糖剝奪模型的基礎(chǔ)上證明let-7i下調(diào) TLR4 的表達(dá)，降低MMP9和iNOS的含量，由此減輕模型中人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷。這可能是let-7i調(diào)控急性缺血性卒中過程的作用機(jī)制，但還需要大量臨床資料支撐及分子實(shí)驗(yàn)研究證明。

1.2 let-7與細(xì)胞凋亡

腦缺血半暗帶損傷是決定缺血性卒中患者嚴(yán)重程度及預(yù)后的主要因素，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是此區(qū)發(fā)生的主要病理改變，屬于遲發(fā)性病變。且腦缺血后調(diào)節(jié)凋亡的miRNAs的水平變化與這種現(xiàn)象一致。研究表明腦缺血患者血清let-7 家族成員let-7e 和miR-98一致性下調(diào)，可能通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)而導(dǎo)致缺血區(qū)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步誘導(dǎo)腦缺血損傷[22]。

Caspase-3是腦缺血再灌注損傷時(shí)介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行因子[23]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注后30min和24h海馬區(qū)的let-7a/7b/7c/7d/7e/7f/miR-98表達(dá)均下調(diào)，而一些有害蛋白如Caspase-3表達(dá)明顯增高且持續(xù)較長時(shí)間。袁圓通過體外誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型研究發(fā)現(xiàn)let-7e可能通過下調(diào)促凋亡基因Caspase-3mRNA和蛋白表達(dá)，而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能的作用[24]。雖已有研究者用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Caspase-3是let-7a的作用靶點(diǎn)，但其具體作用暫不明確。let-7家族中其他成員是否能靶向調(diào)控Caspase-3表達(dá)影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡還待驗(yàn)證。

Fas配體、TNF受體作為TNF超家族成員調(diào)節(jié)全腦缺血后的神經(jīng)元凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)短暫腦缺血再灌注后Fas配體、TNF受體明顯上升，且查詢生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)Fas配體、TNF受體可能是let-7家族的靶基因，因此提出腦缺血后let-7家族表達(dá)下調(diào)，可能使與細(xì)胞凋亡有關(guān)的因子、配體和受體表達(dá)增高，導(dǎo)致神經(jīng)元受損加重這一合理假設(shè)，具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

1.3 let-7與血管內(nèi)皮功能及血栓形成

血管內(nèi)皮損傷及血栓形成是急性腦梗死的重要病理基礎(chǔ)，不僅增加腦梗死發(fā)生機(jī)率，且使其加重。研究表明let-7f在血管內(nèi)皮中發(fā)揮重要調(diào)控作用[25]。低表達(dá)let-7f激活蛋白依賴性激酶，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，使血管內(nèi)壁增厚，管腔狹窄，腦組織血供減少，誘導(dǎo)腦梗死發(fā)生；此外下調(diào)let-7f損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，大量膠原組織暴露，刺激組織因子釋放，血小板聚集增加，血液流動(dòng)性降低，凝血反應(yīng)鏈被激活，促進(jìn)腦動(dòng)脈血栓形成；let-7f減少可介導(dǎo)細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并激活內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞相應(yīng)的趨化因子受體，促進(jìn)高凝和纖溶亢進(jìn)，，增加血液黏滯度，促進(jìn)血栓形成，最終誘發(fā)急性腦梗死[26]。let-7f可減少細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)血管內(nèi)皮之間緊密結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步維持血腦屏障穩(wěn)定。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是腦動(dòng)脈血栓形成的主要病理基礎(chǔ)之一，也是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素，抑制AS形成，對防治腦卒中具有積極作用。目前廣泛認(rèn)為慢性炎癥是其形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[27]。炎癥標(biāo)志物IL-6釋放可激活體內(nèi)補(bǔ)體及凝血機(jī)制，誘導(dǎo)活性因子如組胺、氧自由基及興奮性氨基酸等釋放，引起機(jī)體微循環(huán)障礙，使血液高凝，促進(jìn)血栓形成，參與急性腦梗死疾病過程[28]；而let-7f下調(diào)炎癥標(biāo)志物IL-6表達(dá)，抑制動(dòng)脈粥樣斑塊形成，維持其穩(wěn)定性，從而調(diào)控腦梗塞發(fā)生發(fā)展。功能學(xué)研究表明，let-7e能調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的敏感性和耐受性[29]，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。且在腦卒中急性期，血小板破壞或消耗增加，刺激骨髓巨核細(xì)胞增生和新生血小板生成，而let-7e可能參與血小板的生成及活化，影響血栓形成，其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。Slava等[30]在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)let-7g和miR-98靶向抑制炎癥分子CCL2和CCL5分泌，減少內(nèi)皮細(xì)胞與炎性細(xì)胞之間的黏附及內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)緊密連接，減少炎性滲漏，保護(hù)血腦屏障及細(xì)胞內(nèi)皮功能。Liao等[31]發(fā)現(xiàn)Let-7g可通過TGF-β途徑抑制THBS1，TGFBR1和SMAD2炎癥相關(guān)基因表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和單核細(xì)胞粘附，抑制血管內(nèi)膜增生，保護(hù)內(nèi)皮功能。此外，Let-7g通過增加SIRT-1表達(dá)保護(hù)內(nèi)皮正常功能，下調(diào)PAI-1的表 達(dá)減少巨噬細(xì)胞浸潤益于維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)。

1.4 Let-7與神經(jīng)再生及血管生成

腦缺血后神經(jīng)元及新血管的生成，有利于增加缺血腦組織血供，神經(jīng)功能恢復(fù)，與腦梗塞患者疾病嚴(yán)重程度、預(yù)后及并發(fā)癥相關(guān)聯(lián)。在大鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型中，使用芯片分析和qPCR技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)48小時(shí)再通后腦組織中與神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的let-7明顯上調(diào)。既往研究中發(fā)現(xiàn)let-7i的表達(dá)缺失可以抑制神經(jīng)的再生，還可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)參與神經(jīng)元的分化及凋亡，具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[32]。

人們最早通過Dicer和Drosha敲除法發(fā)現(xiàn)let-7家族在內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，let-7f可通過靶向抗血管生成基因促進(jìn)血管生成，成為調(diào)節(jié)血管生成有力的靶點(diǎn)。其中l(wèi)et-7f下調(diào)可明顯抑制新生血管形成，其主要調(diào)控機(jī)制是影響血小板反應(yīng)蛋白、Nrp-2、TIMP-1、TEK、Tie-1、VEGFR2等血管生成相關(guān)的因子的表達(dá)[33]。NDRG3是人體內(nèi)一種氧調(diào)節(jié)蛋白，缺氧條件下體內(nèi)堆積的大量乳酸與之結(jié)合抑制其降解，同時(shí)激活低氧誘導(dǎo)的Raf-ERK途徑，促進(jìn)新生血管形成和神經(jīng)細(xì)胞再生。姚要兵等[34]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)let-7f負(fù)調(diào)控NDRG3基因及蛋白表達(dá)參與血管及細(xì)胞再生。

2 Let-7作為腦缺血的血清學(xué)指標(biāo)

臨床上采集血清標(biāo)本檢測血清學(xué)指標(biāo)可協(xié)助快速診斷疾病，了解治療效果及評估患者的預(yù)后。在MCAO模型大鼠缺血再灌注24h及 48h后均可檢測到腦內(nèi)和血液中l(wèi)et-7水平變化。Let-7具有miRNA高度保守的特性，在血漿中穩(wěn)定表達(dá)，且其在血液中的水平隨疾病發(fā)生逐漸變化，這說明血漿中l(wèi)et-7水平高低可以反應(yīng)疾病的不同階段。研究發(fā)現(xiàn)[35]急性腦梗死患者體內(nèi)血清let-7f表達(dá)水平變化明顯，且能輕易通過損傷血腦屏障及細(xì)胞膜，穩(wěn)定存在于血液中，與腦梗死梗死灶面積的大小、嚴(yán)重程度及神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)，可作為臨床輔助診斷急性腦梗死的血清學(xué)指標(biāo)。此外有研究證明let-7f早期聯(lián)合IL-6檢測能特異性診斷急性腦梗死，具有較高的靈敏度，值得臨床推廣和應(yīng)用。彭國平等[36]在腦梗患者發(fā)現(xiàn)let-7e表達(dá)的特異性高達(dá)73.4%和敏感性達(dá)82.8%。其表達(dá)水平在急性期最高，隨著病程延長而逐漸下降，在慢性期最低，提示let-7e可作為判定急性腦卒中潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，尤其急性期臨床價(jià)值更大，對預(yù)測腦梗死的預(yù)后方面也有重要意義[37]。黃志軍等[38]通過檢測腦梗塞患者與正常健康人外周血miRNA的差異表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)腦梗塞患者外周血漿let-7b明顯上調(diào)，可能是急性腦梗塞潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物。

3 總結(jié)與展望

Let-7在急性缺血性卒中診斷中的應(yīng)用雖已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但let-7作為卒中生物學(xué)標(biāo)志物的靈敏度及特異性標(biāo)準(zhǔn)不一，目前研究還存在諸多不足，尚無一種得到國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)可以應(yīng)用于臨床腦梗塞的診斷和預(yù)后評估[39]。此外miRNA應(yīng)用于臨床治療仍存在很大爭議。Let-7除了能夠調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)外，同時(shí)也受其他物質(zhì)調(diào)控，形成相應(yīng)的生物反饋機(jī)制，目前其用于臨床治療的研究大多關(guān)于miRNA類似物、抑制劑的使用，但miRNA與目標(biāo)基因并非一對一調(diào)控的關(guān)系，在發(fā)揮治療作用的同時(shí)，同時(shí)也可能產(chǎn)生或多或少的副作用。但也因miRNA這種多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn)，為疾病發(fā)病機(jī)制研究打開一扇新的大門。目前Let-7在腦血管疾病作用的研究尚處于起步階段，無論是在基礎(chǔ)研究還是臨床診斷治療、預(yù)后及藥物開發(fā)中均大的潛力和價(jià)值，且let-7具有明顯的組織特異性，在不同腦組織、血液甚至其他體液中表達(dá)均有明顯差異，今后有必要對不同腦組織中l(wèi)et-7家族在生理及病理情況下的表達(dá)變化作進(jìn)一步深入研究，有助于揭示腦缺血組織分子生物學(xué)特性，進(jìn)行篩選及定位，為進(jìn)一步深入研究其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為腦梗塞治療提供載體或靶點(diǎn)，可能成為無數(shù)腦梗塞患者的福音。