平菇胞外酶研究進展綜述

方洪楓 趙光輝 吳漢瓊 鄭英姿 林 原 陳 劍 陳躬國

平菇胞外酶研究進展綜述

方洪楓 趙光輝 吳漢瓊 鄭英姿 林 原 陳 劍 陳躬國

（福州市農業科學研究所，福州 350018）

介紹平菇胞外酶的兩種常用研究方法：鑒別平板檢測法和分光光度法。從纖維素酶系和木質素酶系兩大種類概述平菇胞外酶研究的最新進展及主要成果，對平菇胞外酶的進一步深入研究提出構想。

平菇；胞外酶；平板檢測；分光光度；纖維素酶；漆酶

酶由活細胞產生，是對相應底物具有特異性催化作用的蛋白質或RNA。胞外酶是指在細胞外起作用的酶。平菇是有一定栽培規模的可食用大型真菌，在其生長發育過程中菌絲能夠分泌大量胞外酶。平菇的胞外酶將培養料中大分子的纖維素和蛋白質分別分解成小分子的單糖和氨基酸，提供營養物質幫助菌絲生長和子實體發育。國內以平菇菌種選育和栽培技術等方面的研究為主，對胞外酶的研究報道并不多。根據目前已發表的文獻，對平菇胞外酶的研究多集中于水解酶類，如漆酶、羧甲基纖維素酶、淀粉酶和多酚氧化酶。本文綜述平菇胞外酶活性的兩種研究方法和對兩類胞外酶的最新研究進展，為進一步研究平菇胞外酶提供理論參考。

1 研究方法

1.1 鑒別平板檢測法

鑒別平板檢測法是快速篩選菌株的方法，包括平板透明圈法和平板變色圈法。平板透明圈法是在固體培養基中摻入營養物質，待測菌株產生特定胞外酶分解營養物質，在菌落周圍形成透明圈。平板變色圈法是指在固體培養基中摻入指示劑，絕大多數胞外酶能夠與某些特定的物質在短時間內發生顯色反應[1]。透明圈和變色圈的大小能夠反映菌株利用和分解營養物質或指示劑等特定物質的能力，根據圈的大小，可初步判斷菌株產胞外酶的能力高低。

龔娜等以不同含量的純玉米芯為唯一碳源，采用剛果紅平板變色圈法快速篩選出產胞外纖維素酶的平菇菌株，能很好解決過去栽培周期長、空間大等條件限制的問題[2]。韋錦范采用愈創木酚、單寧酸和ABTS為底物的培養基初步篩選平菇產漆酶能力，根據透明圈/菌絲圈大小和變色特征，獲得8個漆酶活力較高的菌株[3]。高鋒等通過平板變色圈試驗發現，選用的平菇菌株能分泌羧甲基纖維素鈉酶、淀粉酶、漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶等5種胞外酶[4]。應立立等通過平板變色圈法篩選平菇木質素降解菌株，結果以紅平菇降解木質素的能力最強[5]。宋安東等對不同平菇菌株在PDA-Bavendamm平板和PDA-RB亮藍平板上進行顯色試驗，根據菌株在PDA-Bavendamm平板上形成的棕褐色輪環和在PDA-RB亮藍平板上形成的橙黃色變色圈，檢測出33個菌株能產漆酶，所有平菇菌株均可產生過氧化物酶[6]。

鑒別平板檢測法是從大量食用菌菌株中篩選產目標胞外酶菌株的常用方法，是找到目標菌株及判斷其能否產酶的關鍵基礎步驟，可以簡單快速地辨別出該菌株是否產酶，為平菇等多種食用菌的產酶菌株篩選減少了大量的工作量和不必要的人力、物力消耗。同時通過透明圈或變色圈的直徑大小與菌落直徑大小的比值，可初步評價菌株的產酶能力，為后續定量測定酶活力大小提供參考。

1.2 分光光度法

分光光度法是通過測定被測物質在特定波長內的吸光度，對該物質進行定性和定量分析的方法。這是生物化學實驗中最常用的方法之一，常見如用ABTS法測漆酶，DNS法測還原糖。

胡素娟等采用DNS法測定羧甲基纖維素酶活性，采用ABTS法測定漆酶活性，采用紫外分光光度計法測定中性蛋白酶活性，對比玉米芯、棉籽殼基質發酵料栽培平菇不同生長階段平菇胞外羧甲基纖維素酶（CMC）、木聚糖酶、中性蛋白酶和漆酶的活性[7]。周孟清等用分光光度法等對粗酶液的酶活性質研究結果，平菇可產錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）[8]。Sathishkumar和Palvanan取平菇液體培養對數期發酵液測漆酶活性，以ABTS作為反應底物，濃度1 mmol/L，100 mmol/L反應緩沖體系為醋酸溶液反應體系，pH 5.5，反應溫度為30 ℃，在420 nm波長下測定吸光度[9]。最近，也有研究者采用愈創木酚法測定側耳屬的漆酶活性[10]。

分光光度法是實驗室定量檢測平菇菌株中胞外酶的方法，長時間的大量其他實驗已證明該方法的精確性、可重復性，及其所得實驗結果的快速、安全、可靠，克服了平板檢測法中菌株易受培養基厚度和pH值、指示劑的影響，以及受觀察時間、培養溫度等客觀因素的干擾等問題，能夠進一步驗證和支持鑒別平板法的檢測結果。

2 胞外酶種類

2.1 纖維素酶系

纖維素酶可以將大分子纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質，在分解纖維素時起生物催化作用。平菇栽培主要以含有大量纖維素的棉籽殼、木屑、棉稈等為原料，胞外纖維素酶可將纖維素分解成小分子營養物質供菌絲體吸收、利用和子實體生長發育。羧甲基纖維素酶、濾紙酶皆屬于纖維素酶系。

溫海祥等通過比較平菇不同品種間羧甲基纖維素酶的酶活大小，發現品種間纖維素酶活力存在顯著差異[11]。孫江慧等研究發現平菇‘韓黑’分泌的纖維素酶活力較高，纖維素降解率高達45.84%，是產纖維素酶的優勢菌株[12]。馮光志等研究發現，Zn2+能促進平菇胞外羧甲基纖維素酶的產生，在菌絲生長期胞外羧甲基纖維素酶活性較弱，之后逐漸升高，在子實體成熟期，達到峰值，為19.87 U/g，子實體采摘后酶活隨之下降[13]。洪培等研究表明，Zn2+和Mn2+有效提高了纖維素酶活性，而Fe2+和Cu2+則抑制產酶活力[14]。傅真杰等發現適量 Mn2+和 Mg2+能促進平菇菌絲發育和子實體形成，其中Mg2+能較大程度提升平菇纖維素酶活力，0.125 g/L Mg2+可使平菇纖維素酶活提升45. 05%[15]。

纖維素酶是平菇胞外酶研究中最常見的一類，目前研究主要集中在比較不同平菇品種間纖維素酶的活力和如何提高平菇纖維素酶活力。研究纖維素酶對平菇生產具有一定的指導意義，如篩選高產平菇菌株，生產過程中添加微量元素提高產量等。

2.2 木質素酶系

漆酶和多酚氧化酶都是降解木質素的重要催化劑，屬于木質素酶系。它們將木質素芳香族高分子化合物分解為小分子物質供菌絲生長。胞外漆酶和多酚氧化酶活性越強，菌株降解木質素的能力就越強。

孫江慧等通過試驗比較，發現平菇8號降解木質素的能力較強，木質素降解率可達49.46%[12]。吳楠等研究的結果，紅平菇在大豆秸稈基質中產漆酶活性最強，菌絲生長旺盛，推測大豆秸稈中木質素含量較高，有利于促進平菇產漆酶[16]。玄家潔對平菇雙抗、860、89等3個品種進行搖瓶發酵，比較菌絲長勢和漆酶活力，發現菌絲的生長勢與漆酶活力大小具有相關性[17]。周佳君等研究發現多酚氧化酶與平菇的褐變有關，因此提出在平菇的生產儲存與運輸過程中應避免促進多酚氧化酶產生的因素，以降低平菇的耗損[18]。楊清香等通過在玉米粉液體培養基中進行發酵，發現2個平菇菌株能夠在液體發酵液中分泌高活性的漆酶，其中平菇831在液體中產酶活性于第10天達到最大值，為18 053.3 U/L[19]。申進文等對平菇漆酶的研究證實，平菇在菌絲生長階段的漆酶活性最高，進而發現在第一、二潮菇的間期，漆酶活性出現次高峰[20]。陳建軍等通過測定平菇在種子袋內和出菇后不同生長階段的漆酶酶活，發現平菇831在菌絲生長時期漆酶的分泌量最高，最大值為151.6 U/g，而出菇后的漆酶酶活幾乎降為0。說明菌絲生長需要漆酶參與，而子實體的發育則不再需要漆酶的參與[21]。

3 深入研究構想

我國的平菇種類多、產量高，具有明顯的種質資源優勢，開展平菇胞外酶的研究，對于提高平菇產量和合理開發利用種質資源具有重要意義。在有關平菇胞外酶的研究中，對漆酶的研究較為深入，也取得了一定的成果，但仍有很大的研究空間。目前大多數試驗仍處于實驗室研究階段，并未將試驗結果運用于實際生產中。對于平菇漆酶的合成、作用機理和規律，酶的分離、純化及應用于規模化生產等，都有待于進一步的深入研究。關于平菇胞外酶活性的測定，可以探尋更多的方法，通過比較不同研究方法之間的準確性，優選出最適合的一種。隨著分子技術和基因工程的不斷進步發展，將會有更多平菇的纖維素酶系和木質素酶系的編碼基因被分離出來，可為平菇轉基因研究提供豐富的目的基因源，進一步促進平菇的研究。

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福建省福州市科技計劃項目（2017-N-46），現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS24）

方洪楓（1991—），女，碩士研究生，研究實習員，研究方向為微生物生理生化， E-mail：515512489@qq.com。

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