七方胃痛顆粒對人結腸癌耐藥細胞株Caco-2增殖與凋亡的影響

張天彬，彭飛燕，吳 瑕，盛囝靖，陳國忠

（1.浙江中醫藥大學附屬杭州西溪醫院，杭州 310023；2.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530001；3.東陽市中醫院，浙江 東陽 322100；4.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023）

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，抑制結腸癌耐藥細胞株的增殖、侵襲、轉移且誘導其凋亡是提高臨床療效的關鍵[1-2]。自研究發現腫瘤多藥耐藥現象以來，雖幾經研究干預治療，然腫瘤多藥耐藥所導致的化療失敗，依舊是腫瘤治療中存在的難點[3]。七方胃痛顆粒對胃惡性腫瘤細胞具有一定的抑制作用，且未見明顯毒副作用[4-5]。本研究旨在探討七方胃痛顆粒對人結腸癌耐藥細胞株Caco-2 的影響，為今后七方胃痛顆粒防治結腸癌提供實驗依據。

1 材料

人結腸癌耐藥細胞株Caco-2 獲購于上海慧穎生物科技有限公司，由本實驗室傳代培養；七方胃痛顆粒方藥組成：由紅參10 g，白術10 g，生黃芪30 g，茯苓10 g，炙甘草9 g，白芍30 g，炒雞內金9 g，枳實10 g，木香6 g，黃連6 g，吳茱萸3 g，丹參6 g，免煎中藥顆粒（國藥準字 Z20123053）由江陰天江藥業有限公司生產，廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，顆粒被混合攪勻并按每袋8 g 的規格滅菌包裝，實驗前稱取所需劑量藥物[6]。實驗大鼠20 只，平均體質量（96±10）g，購于湖南長沙天勤生物技術有限公司，飼養于廣西中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物房，用于制備藥物血清。四甲基偶氮唑鹽 （MTT）（sigma,美國）；流式細胞分析儀（美國BD,C6）；流式細胞檢測所用的試劑盒（美國BD,556547）；DMEM 高糖培養基及胰蛋白酶（Gibco,1505-065,美國）；全自動酶標儀（Thermofisher,Multiscan FC,美國） ；CO2細胞培養箱（thermo,美國）。

2 方法

2.1 細胞株與菌株的培養 將人結腸癌耐藥細胞株Caco-2 置于內含10%的胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素及10 萬 U/L 的青霉素DMEM 培養基，放置于CO2濃度為5%的細胞培養箱內培養，箱內設置為37 ℃常溫。

2.2 藥物血清制備 將大鼠隨機分為七方胃痛顆粒藥物血清組和空白對照組各10 只，按成人用藥體重劑量比值，將中藥換算為50 g/kg 的濃度，繼而給藥物血清組的大鼠灌胃，連續灌服5 d；空白對照組的大鼠則予灌服與藥物血清組等體積的生理鹽水，連續灌服5 d。灌胃結束后2 h，大鼠腹主動脈采血，分離血清，56 ℃滅活，使用0.22 μm 微孔過濾除菌，分裝保存。

2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法 實驗分為5 組，A組：空白對照組，B 組：加入體積分數為2.5%的七方胃痛顆粒藥物血清，C 組：加入體積分數為5.0%的七方胃痛顆粒藥物血清，D 組：加入體積分數為10.0%的中藥藥物血清，E 組：加入體積分數為20.0%的中藥藥物血清。分別作用于細胞株24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 液 20 μL，培養箱避光培養4 h 后，每孔加入150 μL 的二甲基亞楓溶液，避光震蕩15 min，使結晶物充分融化，并在調至波長為490 nm的酶標儀上測定各孔吸光值（OD 值）。并以下列公式計算細胞抑制率：細胞生長抑制率（%）=（1－實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

2.4 流式細胞術（FCM）實驗 在6 孔板中接種耐藥細胞株Caco-2，于孔板中孵育24 h 后，各等份Caco-2細胞加入下列組別中，B 組（體積分數為2.5%的中藥藥物血清）、C組（體積分數為5.0%的中藥藥物血清）、D 組（體積分數為10.0%的中藥藥物血清）、E 組（體積分數為20.0%的中藥藥物血清），另設空白對照組A 組。實驗給藥方法與MTT 檢測相同，培養48 h 后，分別收集各組細胞，用預冷的70%乙醇固定24 h，并用胰蛋白酶消化，收集制成細胞懸液；檢測前細胞懸液用 PBS 洗滌2 次，棄上清液，收集細胞沉淀液，加入150 μL RNA 酶A（0.1 mg/mL）和120 μL 碘化丙啶，保持在舒適的室溫下避光孵育15 min；然后將細胞懸液混勻，用尼龍膜過濾細胞管過濾去除細胞團塊，1 h內上流式細胞儀檢凋亡細胞率。

2.5 統計學方法 使用SPSS 16.0 軟件對相關數據進行統計學描述和分析，采用單因素方差分析和配對t檢驗。

3 結果

3.1 七方胃痛顆粒抑制細胞株Caco-2 增殖的作用 見表1。

3.2 七方胃痛顆粒誘導細胞株Caco-2 凋亡的作用 見表2。

表1 七方胃痛顆粒不同濃度藥物血清對Caco-2 細胞抑制率的比較（） %

表1 七方胃痛顆粒不同濃度藥物血清對Caco-2 細胞抑制率的比較（） %

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與A 組、B 組比較，△P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組比較，▲P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組、D 組比較，□P ＜0.05

表2 各組人結腸癌耐藥細胞Caco-2 凋亡率的比較（）%

表2 各組人結腸癌耐藥細胞Caco-2 凋亡率的比較（）%

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與A 組、B 組比較，△P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組比較，▲P ＜0.05；與A 組、B 組、C 組、D 組比較，□P ＜0.05

4 討論

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,手術和放、化療雖然是目前治療該病的主要方法,然而其毒副作用、耐藥性等問題尚未得到根本解決[7-8]。中醫藥治療惡性腫瘤療效肯定，毒副作用小，具有整體調節的特點[9]，其治療機制通過調節臟腑氣血，糾正機體陰陽失衡，改善人體內在環境，來達到抗腫瘤的效果[10]。七方胃痛顆粒為全國名老中醫羅偉生教授臨證治療胃腸疾病的經驗方，由四君子湯、左金丸、逍遙散、丹參飲、枳術丸、枳實芍藥散、木香檳榔丸合方而成，主要藥物組成為紅參、黃芪、茯苓、白術、炙甘草、丹參、木香、黃連、吳茱萸、白芍、枳實、炒雞內金，具有健脾益氣、活血化瘀、清利濕熱、理氣止痛等功效[11-18]，課題組前期研究發現，七方胃痛顆粒可以抑制人胃癌SGC-7901 細胞的生長[6]。

Li 等研究表明，Caco-2 細胞來源于人體的結、直腸癌細胞，通過誘導Caco-2 細胞凋亡，抑制細胞的增殖，可以達到抗結腸癌的作用及其具有預防癌細胞轉移的效果[19]。研究結果表明，七方胃痛顆粒對人結腸癌耐藥細胞株Caco-2 有明顯的生長抑制作用，并能誘導Caco-2 細胞凋亡，且與藥物血清濃度及作用時間呈正相關性。