水果酵素發酵過程細菌變化規律研究

朱會霞，孫金旭，高 越，王 茜，李雪珍

(衡水學院，河北 衡水 053000 )

酵素作為營養食品目前在多個國家及地區都十分流行[1]。酵素是指以水果蔬菜、菌類、動物、藻類等作為原料，經微生物發酵而形成的，含有特定生物活性成分的產品[2]。常見的水果蔬菜、藥食同源中藥等都可以作為酵素發酵的原料[3]。水果酵素主要是水果作為原料，經過一段時間發酵后得到的可食用的發酵果汁，含豐富的肽類物質、多糖類(小分子)、維生素類物質、多酚類、氨基酸、有機酸、礦物質及可溶性纖維素等生理活性成分。這些成分分一部分來自原料，另一部分來自微生物的代謝過程。

酵素的功效與作用：酵素通過合理的選取原料、合適的發酵工藝，能夠制作出多種酵素產品[4-5]。酵素中含有的一些物質，如多酚類物質、維生素A、維生素C和維生素E等，能夠清除人體代謝得到的氧自由基，具有抗氧化的功能。已經有實驗證實的姜黃素、異黃酮、沒食子酸、木酚素、花青素、阿魏酸、咖啡酸等成分可通過抑制致癌物活化而抑制腫瘤[6]。礦物質進入人體后可以保持蛋白質合成、細胞分裂及神經傳遞的正常進行[7]。酵素中含有人體必需的適量丁酸，通過實驗研究發現丁酸可以修復腸黏膜，對治療腸炎有重要作用，在防治結腸直腸癌和調節基因表達等方面有十分重要的作用。果蔬酵素中的可溶性纖維素纖維膳食雖然不能被消化吸收，但有促進腸道蠕動等功效，對身體健康至關重要[8]。

高通量測序是由Handelsman等提出的，可以覆蓋樣品中全部微生物，真實地反應微生物的多樣性、微生物菌落的構成及其在生態中、代謝產物中所發揮的作用。即用原位裂解法或間接提取法提取出樣品的總DNA，或從某些已知DNA序列中挑選出新的基因(簇)[9]。

傳統培養基鑒定微生物是對樣品進行富集擴培，然后在選擇培養基上進行選擇性培養。自然界中能夠人工培養的微生物很少，樣品中多數微生物難以培養，傳統鑒定法培養不出全部微生物[10-11]，無法進行檢測。高通量測序可以對數以萬計的DNA進行測序，對全部微生物種群進行分析，使序列結果分析的速度與準確性都大大提高[12-13]。

當前酵素在我國的發展仍處于初步階段，人們對于酵素生產及工藝方面的研究很少。對于酵素的生產工藝等各個方面還有待更多、更深入的研究。本研究經由水果酵素發酵液細菌總DNA測序來綜合性的判斷發酵細菌的種類，旨在經過測序結果分析水果酵素中的細菌種類，繼而規范優化操作過程，對水果酵素的生產過程采取有效的防范措施，避免其受到雜菌的污染。在水果酵素的工廠化生產過程中，可以有效的調整生產工藝防止污染雜菌，為提高水果酵素品質提供研究思路和技術方面的支持。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

水果酵素(正常發酵和染菌發酵)：實驗樣品源于衡水學院發酵工程實驗室。

細菌DNA提取試劑盒(TIANGENDP302-02)、瓊脂糖(TIANGEN RT101)、蛋白酶K(TIANGEN RT403)、溶菌酶(TIANGENRT401)、DNA Marker(TIANGEN)。

2.2 試驗方法2.2.1 樣品鏡檢

水果酵素發酵過程中所采樣品(正常發酵樣品和疑似污染的發酵樣品)，使用無菌過濾網過濾去除果肉組織后10倍稀釋(使用蒸餾水)。取一滴稀釋液，滴至顯微鏡載玻片的中心位置，緩慢的蓋上蓋玻片(蓋玻片與載玻片成45度角)。找到目標視野，高倍鏡觀察并拍下照片。

2.2.2 樣品總DNA的提取

分別取水果酵素正常發酵樣品和污染發酵樣品的發酵初期、中期和末期三個時期的酵素作為樣品，按照DNA提取試劑盒說明書提取總DNA。

總DNA送至深圳華大基因科技服務有限公司進行。取樣本微生物DNA中的V4-V5區，對其進行PCR擴增[14]、回收，運用Illumina Miseq高通量測序平臺測序[15]，得到物種的FASTA序列。

利用MEGA7軟件對物種進行分析，從NABI NR數據庫得到標準菌株的系列，進行對比分析，得到這一菌株的進化樹，即每種菌所包含的種類，對結果進行可視化展示，挖掘數據中的有效信息。

3 結果與分析

3.1 水果酵素鏡檢結果

把水果酵素(正常發酵和染菌發酵)發酵中期的樣品取出觀察。圖1a所示為水果酵素在正常發酵中期的鏡檢結果，能夠看到視野中桿狀菌占到50%。酵素在正常發酵過程中含有大量醋酸桿菌和乳酸桿菌。從圖1b中可以看到，桿菌遠遠少于球菌。污染的雜菌多為圓形的球菌。

圖1 水果酵素鏡檢結果(發酵中期)

3.2 水果酵素總DNA提取結果

提取的總DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，得到圖2a三個樣品的總DNA的清晰條帶。本階段提取的DNA樣品送至深圳華大基因科技服務有限公司進行分析。

圖2 水果酵素DNA(1-發酵初期，2-發酵中期，3-發酵末期)

3.3 宏基因組測序結果分析

通過測序結果的分析，得到水果酵素正常發酵和染菌水果酵素發酵中細菌的種類與所占百分比。經過數據分析正常發酵和染菌發酵細菌種類的差異，列出表1中24種主要細菌的對比結果。

表1 正常發酵與染菌水果酵素中的細菌種類對比

表1(續)

水果酵素最終產生的各種代謝成分是由多種細菌在發酵過程的各個階段共同作用形成的。如表1所示的在發酵中總體數目較多的24種細菌，乳酸桿菌和醋酸桿菌在水果酵素的整個發酵階段中所占比例相對較大。

通過對數據處理，分析得到水果酵素中百分比的細菌種類有6種，分別是醋酸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、酸硫桿狀菌、明串珠菌、嗜酸菌。下面分別進行分析。

圖3 醋酸桿菌進化樹

醋酸桿菌是一類短桿菌，均能使糖類和酒精氧化成醋酸等產物。如圖3所示，水果酵素發酵過程的醋酸桿菌有釀酒醋酸桿菌(Acetobacter cerevisiae)、奧爾良醋桿菌(Acetobacter orleanensis)、蘋果酸醋桿菌(Acetobacter malorum)、河口醋桿菌(Acetobacter estunensis)、硝化醋酸桿菌(Acetobacter nitrogenifigens)、干燥醋酸桿菌(Acetobacter sicerae)、歐洲醋桿菌(Acetobacter europaeus)等多種。

醋酸桿菌在總細菌中的比重隨發酵時期的不同而不斷變化。如圖4所示，在正常發酵過程中醋酸桿菌隨發酵的進行不斷增加；醋酸桿菌含量從26%升至56%，含量最高。水果酵素發酵初期的醋酸桿菌隨著發酵的進行增殖代謝越來越旺盛[16]，可利用糖類生成醋酸等產物。但在染菌酵素中醋酸桿菌的數量隨著發酵進行不斷減少，從26%降至16%。

圖4 醋酸桿菌在水果酵素發酵和染菌酵素發酵過程中數量變化

圖5 乳酸桿菌進化樹

圖6 乳酸桿菌在水果酵素發酵和染菌酵素發酵過程中數量變化

如圖5所示，乳酸桿菌包含副酸乳桿菌(Lactobacillus paralimentarius)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、未分類乳酸桿菌(Lactobacillusunclassified)。在正常發酵中，乳酸桿菌在整個發酵中緩慢增加，從15%增加至19%在發酵末期達到最高。而在染菌發酵過程中，乳酸桿菌的數量初期很低，隨著發酵的進行而增加，但也低于正常發酵(圖6)。

圖7 芽孢桿菌進化樹

圖8 芽孢桿菌在水果酵素發酵和染菌酵素發酵過程中數量變化

如圖7所示芽孢桿菌包含枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)等。在正常發酵中，芽孢桿菌隨發酵進行百分比降低，從13%降至3%。在染菌發酵過程中，芽孢桿菌隨著發酵進行百分比增加(圖8)。

圖9 明串珠菌進化樹

圖10 明串珠菌在水果酵素發酵和染菌酵素發酵過程中數量變化

如圖9所示，明串珠菌包含腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、酒明串珠菌(Oenococcusoeni)。在水果酵素正常發酵過程中，明串珠菌在所有發酵細菌中所占百分比隨發酵進行逐步降低，從18%降至7%。明串珠菌在pH值為3.0～6.5時生長最好，但隨著發酵進行pH值逐漸降低至3以下，導致明串珠菌減少。而在染菌發酵中，明串珠菌隨著發酵的進行，不斷增加(圖10)，從3%升至18%。

圖11 嗜酸菌進化樹

圖12 嗜酸菌在水果酵素發酵和染菌酵素發酵過程中數量變化

如圖11所示，嗜酸菌主要有嗜酸硫化桿菌(Sulfobacillus acidophilus)系列。水果酵素正常發酵過程嗜酸菌百分比不斷增加，從2%增加至6%；而在染菌發酵過程中，嗜酸菌的數量隨著發酵的進行而減少，發酵中后期僅有2%(圖12)。

4 結論

本實驗對水果酵素正常發酵的初中末期的和染菌發酵不同階段的樣品取樣，通過鏡檢、對DNA進行提取、總DNA的PCR擴增及宏基因組測序等步驟測定酵素發酵液中細菌種類及數量變化。確定了正常發酵水果酵素中主要含有的細菌種類，正常發酵過程醋酸桿菌、乳酸桿菌、嗜酸菌均逐漸增加，而芽孢桿菌、明串珠菌是逐漸減少的。而染菌發酵過程醋酸桿菌不斷降低，腸膜明串珠菌、乳酸鏈球菌和酒明串珠菌的迅速增殖抑制了醋酸桿菌。本次研究發現細菌在繁殖過程中相互作用，雜菌的繁殖影響了水果酵素正常代謝，后續研究可以在發酵過程中控制某些細菌的生長，使水果酵素發酵過程控制在穩定的狀態。