靶向多肽SS-31對(duì)載脂蛋白E敲除動(dòng)脈粥樣硬化大鼠干預(yù)效果研究

汪潔，任何，黨晶藝，張東偉，郝啟萌

心腦血管疾病一直是全球發(fā)病率最高的疾病種類之一，具有較高的致殘率和致死率[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化是一類以脂質(zhì)代謝障礙為病變基礎(chǔ)，以鈣質(zhì)沉著、動(dòng)脈壁增厚變硬及血管腔狹窄為特征的慢性炎性疾病，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的探究是防治心血管疾病的關(guān)鍵[3-5]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，包括膽固醇代謝障礙、損傷反應(yīng)、炎性反應(yīng)、平滑肌增殖等都可能會(huì)對(duì)該進(jìn)程產(chǎn)生影響[6-7]。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究指出，動(dòng)脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等促炎性細(xì)胞密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞會(huì)吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞進(jìn)一步聚集形成壞死核心，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[8-9]。ApoE基因敲除大鼠多被應(yīng)用于脂質(zhì)代謝紊亂動(dòng)物研究，其纖維斑塊的形成與人類極其相似，可模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化病理表現(xiàn)[10]。臨床試驗(yàn)指出，SS-31對(duì)缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性病變、胰島素抵抗等均具有較好的治療效果，但關(guān)于SS-31與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程間的研究較少[11-12]。研究觀察靶向多肽SS-31對(duì)ApoE敲除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果，并分析其原因，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物及分組：選取8周齡的ApoE基因敲除雄性大鼠60只，SPF級(jí)，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2013-0034]，體質(zhì)量320～351(336.23±12.03)g。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組30只。2組大鼠均飼養(yǎng)于常規(guī)環(huán)境下，給予高脂飲食(0.2%膽固醇與20%脂肪混合型飼料)喂養(yǎng)。(2)儀器：奧林巴斯CX33光學(xué)顯微鏡，邁瑞B(yǎng)S-490 全自動(dòng)生化分析儀，奧林巴斯OLS4100激光共聚焦顯微鏡，賽默飛Micro 17R/21R微量臺(tái)式離心機(jī)。(3)試藥與試劑：SS-31粉末購(gòu)自蘇州強(qiáng)耀生物科技技術(shù)有限公司，戊巴比妥 ATP試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾美捷科技技術(shù)有限公司，一抗、二抗、CD36抗體、LOX-1抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年12月—2019年4月于中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠以SS-31(粉末0.02 g加入生理鹽水100 ml制成0.2 mg/ml藥物溶液)5 ml·kg-1·d-1劑量皮下注射，對(duì)照組大鼠則予生理鹽水5 ml·kg-1·d-1皮下注射，2組大鼠干預(yù)時(shí)間均為12周。12周后予2組大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，經(jīng)下腔靜脈取血5 ml備用；加深麻醉后頸脫位處死，收集大鼠心臟及主動(dòng)脈標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 標(biāo)本處理： 心臟標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定1d后石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切取10張，厚度6 μm； 主動(dòng)脈竇冰凍切片置于丙二醇中靜置2 min，油紅O染色16 h，85%丙二醇分化1 min，蘇木素染色3 min，封片，奧林巴斯CX33光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 主動(dòng)脈斑塊指標(biāo)檢測(cè)：上述標(biāo)本處理中，大鼠10只實(shí)施主動(dòng)脈弓染色，觀測(cè)斑塊面積及大小。

1.3.3 血脂和炎性指標(biāo)檢測(cè)：上述血液標(biāo)本5 ml離心獲得血清，采用邁瑞B(yǎng)S-490全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)的含量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)檢測(cè)血清細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)。

1.3.4 氧化還原反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)：上述標(biāo)本處理中，主動(dòng)脈竇冰凍切片(厚度6 μm)置于載玻片上，熒光探針(DHE，10 μmol/L，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)37℃避光孵育30 min，奧林巴斯OLS4100激光共聚焦顯微鏡觀察熒光，熒光強(qiáng)弱反映反應(yīng)性氧化物(ROS)水平。主動(dòng)脈離體后立即用ATP檢測(cè)試劑盒及SOD檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ATP水平及總SOD活性。

1.3.5 免疫組織化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：對(duì)大鼠主動(dòng)脈標(biāo)本切片實(shí)施脫蠟處理，抗原修復(fù)后對(duì)2組大鼠組織CD36及LOX-1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；大鼠組織切片脫蠟，抗原修復(fù)，一抗、二抗(1∶200稀釋)室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。

2 結(jié) 果

2.1 2組主動(dòng)脈斑塊面積及大小比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠的主動(dòng)脈斑塊面積(縱切面)及大小(橫切面)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠主動(dòng)脈斑塊面積及大小比較

2.2 2組血脂和炎性指標(biāo)比較 2組TG及TC水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組大鼠血清ICAM-1及MCP-1水平均低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠血脂、炎性指標(biāo)水平比較

2.3 2組主動(dòng)脈ROS、SOD、ATP比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠的ROS及SOD水平明顯低于對(duì)照組，而ATP水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 2組大鼠主動(dòng)脈氧化還原指標(biāo)比較

2.4 2組主動(dòng)脈CD36、LOX-1變化比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠CD36及LOX-1表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 2組大鼠主動(dòng)脈CD36、LOX-1比較

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)研指出，目前心血管疾病已成為死亡率最高的疾病之一，2004年全球約有1 710萬(wàn)人死于心血管疾病，死亡率約占全部疾病的29%，其中死于冠心病人數(shù)達(dá)720萬(wàn)人，死于卒中人數(shù)達(dá)570萬(wàn)人，世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2030年，全球會(huì)有近2 360萬(wàn)人死于心血管相關(guān)疾病[13]。近些年隨著我國(guó)人民生活水平的提升和人口老齡化趨勢(shì)的顯現(xiàn)，各類心血管相關(guān)疾病的發(fā)病率及病死率也有逐年遞增趨勢(shì)[14-16]。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其病變受個(gè)體體質(zhì)、后天環(huán)境等多種因素的影響[17]。其本質(zhì)是以大量脂質(zhì)和膽固醇聚集生成纖維斑塊為特征的慢性炎性疾病。當(dāng)前臨床研究指出，炎性反應(yīng)、膽固醇代謝異常、巨噬細(xì)胞泡沫化、脂質(zhì)代謝障礙等都與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)[18]。

SS-31是一種能夠自由滲入細(xì)胞，并靶向定位于線粒體的小分子肽，臨床研究指出，SS-31能夠清除線粒體內(nèi)過(guò)多的ROS，減少ROS的產(chǎn)生，穩(wěn)定線粒體膜電位，防止線粒體通透性的改變，進(jìn)而阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，SS-31對(duì)線粒體的保護(hù)作用已經(jīng)在多個(gè)研究證實(shí)。學(xué)者通過(guò)將小鼠進(jìn)行分組干預(yù)發(fā)現(xiàn)，小鼠后肢缺血再灌注會(huì)引起肌肉的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和線粒體功能損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)后肢骨骼肌細(xì)胞的凋亡，而SS-31的應(yīng)用能夠較好地保護(hù)線粒體功能，抑制組織炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)小鼠骨骼肌缺血再灌注損傷具有較好的預(yù)防和治療作用[19-20]。朱娛等[21]的研究結(jié)果也顯示，抗氧化劑SS-31能夠降低膿毒癥小鼠海馬體組織中線粒體ROS水平，抑制細(xì)胞凋亡，改善損傷并降低小鼠病死率。

本研究就SS-31對(duì)ApoE敲除動(dòng)脈粥樣硬化大鼠干預(yù)效果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，相比對(duì)照組大鼠，應(yīng)用SS-31干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組大鼠主動(dòng)脈斑塊面積及大小均明顯縮小，血清ICAM-1和MCP-1水平均明顯降低，主動(dòng)脈ROS、SOD、CD36及LOX-1表達(dá)下降，ATP水平上升，提示SS-31具有一定的改善動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的效果。炎性反應(yīng)在介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)程中具有一定作用，內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的起始步驟，受損的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌大量的黏附因子和細(xì)胞因子[22-24]，上調(diào)巨噬細(xì)胞清除劑受體的表達(dá)，加快泡沫細(xì)胞的形成，有研究指出，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處細(xì)胞內(nèi)ICAM-1、MCP-1等因子都處于高表達(dá)狀態(tài)[25-26]，本研究中SS-31的應(yīng)用使ICAM-1、MCP-1水平出現(xiàn)下降，提示SS-31緩解了大鼠主動(dòng)脈炎性反應(yīng)，起到一定保護(hù)內(nèi)皮血管的作用。多項(xiàng)研究都指出ROS生成增加會(huì)上調(diào)氧化應(yīng)激水平，加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，鄒志勇等[27]的研究指出，ROS會(huì)損傷平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的DNA，加快細(xì)胞衰老進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而線粒體DNA損傷或線粒體功能失調(diào)又會(huì)進(jìn)一步上調(diào)ROS水平，形成惡性循環(huán)。ATP水平可以直接反映線粒體功能，因而ATP水平的上升提示大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)有所緩解，CD36及LOX-1的水平也可以反映ROS的強(qiáng)度，因而本研究中實(shí)驗(yàn)組ATP水平的上升，CD36及LOX-1表達(dá)的下降都提示SS-31對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程具有較好的減輕效果。

總之，靶向多肽SS-31對(duì)ApoE敲除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化具有較好的治療效果，分析其原因與該藥能夠緩解大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

汪潔、黨晶藝：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；任何：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;張東偉、郝啟萌：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核