PLA2R基因多態性與成人特發性膜性腎病治療效果及預后的關系

宋 雪 陸 晨

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是常見的腎小球疾病類型之一，發病率逐年上升，成為我國繼IgA腎病之后的第二大原發性腎小球疾病，且相對于繼發性膜性腎病(secondary membranous nephropathy,SMN)，特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)較為常見[1-3]。IMN作為成人腎病最常見的病理類型，其臨床表現多樣，部分患者預后較差，治療仍較為棘手，發病機制復雜且尚不明確。近年來，隨著對IMN發病機制研究不斷深入，發現IMN的發生發展與某些基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點密切相關。已有研究[4]表明，磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor,PLA2R)與IMN進展有關，且其存在基因突變和基因多態性，可能是引起IMN的主要靶抗原。但是，PLA2R基因多態性與IMN治療效果及預后的相關性研究較少。目前研究[5]認為，SNP rs35771982位點位于PLA2R基因胞外結構域中，可能影響PLA2R結構和功能。因此，本研究通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術檢測本院IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點基因型，分析其與成人IMN患者治療效果及預后的關系，以期為IMN臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月新疆維吾爾自治區人民醫院腎內科經腎活檢確診并治療的60例IMN患者為研究對象，病理診斷均符合Ehrenreich-Churg膜性腎病的診斷標準[6]。其中男性35例，女性25例，均為新疆維吾爾族人；年齡18～60歲，平均(48.65±15.36)歲。同期選取60例健康體檢者為對照組，其中男性31例，女性29例，均為新疆維吾爾族人；年齡18～60歲，平均(45.24±13.19)歲。兩組患者基礎資料比較差異無統計學意義(χ2=0.539，P=0.463；t=1.305，P=0.195)。本研究經本院道德倫理委員會批準后實施，所有樣品采集均取得患者或家屬知情同意并簽字。

1.2 試劑與儀器 PCR擴增試劑盒(貨號DR011)購自日本Takara公司；全血基因組DNA提取試劑盒(貨號D1800)購自美國Santa公司；PCR產物回收純化試劑盒(貨號D6492-02)購自美國Omega公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；核酸分析儀(型號2100)購自Agilent公司；PCR擴增儀(型號C1000)、凝膠成像系統(型號Gel Doc 1000)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 所有研究對象抽取清晨空腹靜脈血5 mL于含5% 乙二酸四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的抗凝管中。采用人全血基因組DNA提取試劑盒提取患者全血樣本中的基因組DNA，具體操作嚴格參照試劑盒說明進行。經核酸分析儀測定DNA產物的純度和濃度，確定其OD260/280為1.8～2.0后，將DNA稀釋后分裝，保存于-80℃備用。

1.3.2 PCR-RFLP技術檢測PLA2R基因rs35771982位點的基因型 參照文獻[7]及NCBI GenBank SNP數據庫檢索及比對，選擇位于人類PLA2R基因Gene ID：22925(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)第5號外顯子區的rs35771982位點，并應用Primer Premier 5.0軟件設計擴增引物(引物序列見表1)。PCR反應體系(20 μL)：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Taq 10 μL，ddH2O 6 μL；反應程序：95℃預變性4 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35個循環，72℃延伸10 min。目的基因擴增產物經限制性內切酶Bbs I酶切，37℃消化4 h，65℃ 30 min終止反應。酶切產物經3.0%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統中觀察條帶分布情況，并將PCR擴增產物進行純化后送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。采用Chromas軟件分析測序結果，確定每例IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點基因型。

表1 PCR引物序列

1.3.3 隨訪及觀察指標 IMN組患者隨訪時間為12個月，隨訪過程中觀察每例患者的血壓、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白、血肌酐、血清總膽固醇、血清三酯甘油等指標，并根據慢性腎臟病流行病學合作研究(CKD-EPI)公式計算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。同時，記錄患者在治療期間發生的血糖、尿酸異常升高等不良反應，以空腹血糖值≥6.0 mmol/L為血糖異常，以尿酸值≥420 μmo1/L為尿酸異常，比較不同基因型間血糖、尿酸異常率。

1.4 臨床療效評價 參照《中國成人腎病綜合征免疫抑制治療專家共識(2014)》進行療效判定[8]：①24 h蛋白尿定量<0.3 g，血清清蛋白>35 g/L，尿蛋白陰性為完全緩解；②0.3 g<24 h蛋白尿定量<3.5 g或24 h尿蛋白定量比基線水平下降50%且腎功能穩定為部分緩解；③24 h尿蛋白定量>3.5 g，且下降幅度小于基線水平的50%為未緩解；④經治療后緩解的患者重新出現24 h尿蛋白定量>3.5 g為復發。比較不同基因型間完全、部分緩解率以及復發率，并以完全緩解與部分緩解定義為預后良好，未緩解以及復發定義為預后不良。

2 結果

2.1 IMN組與對照組PLA2R基因SNP rs35771982位點的基因型比較 測序結果顯示，PLA2R基因SNP rs35771982位點存在G/C突變，有野生型純合子GG、突變型雜合子GC、突變型純合子CC 3種基因型。IMN組60例患者中GG 6例(10.00%)、GC 16例(26.67%)、CC 38例(63.33%)，G等位基因頻率為23.33%，C等位基因頻率為76.67%，且其GG基因型、G等位基因比例顯著低于對照組，CC基因型、C等位基因比例顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 IMN組與對照組PLA2R基因SNP rs35771982位點基因型及等位基因分布比較[例(%)]

表3 IMN患者PLA2R基因 SNP rs35771982位點基因多態性與治療緩解率的關系[例(%)]

表4 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點基因多態性與復發率的關系[例(%)]

表5 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點基因多態性與不良反應的關系[例(%)]

2.5 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點基因多態性與不良預后的logistic回歸分析 以本研究資料中CC、GC、GG基因型(GG型=0；GC型=1；CC型=2)、年齡(<45歲=0；≥45歲=1)、血肌酐(<186 μmol/L=0；≥186 μmol/L=1)、24 h尿蛋白定量(<3.5 g=0；≥3.5 g=1)為自變量，以預后情況(預后良好=0；預后不良=1)為因變量，進行logistic回歸分析。在調整年齡、血肌酐、24 h尿蛋白定量等后，結果顯示，SNP rs35771982位點CC基因型是影響IMN患者不良預后的獨立危險因素(OR值=6.634，P<0.001)，相較于GG基因型，CC基因型患者預后不良的風險為6.634倍。見表6。

表6 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點基因多態性與不良預后的logistic回歸分析

3 討論

PLA2R基因位于人類染色體2q23-q24區，其內部包含許多SNP位點。研究[9-12]發現，PLA2R基因SNP位點及基因多態性可通過影響PLA2R抗體形成及足細胞表面PLA2R表達影響IMN的進展。目前，研究[13]證實，PLA2R基因SNP rs35771982位點突變是IMN發病的危險因素，該位點發生G/C突變后天冬氨酸取代組氨酸，導致C型鈣離子依賴性凝集素結構域結構變化，PLA2R的抗原表位暴露并產生特異性抗PLA2R抗體，促進IMN發生發展，并可能影響預后。郭玉等[7]研究發現，中國新疆維吾爾族IMN患者rs35771982位點中CC基因型、C等位基因是其易感基因，也是功能基因。本研究發現，IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點存在GG、GC、CC三種基因型，以CC基因型居多，約占63.33%，且其CC基因型、C等位基因占比顯著高于健康對照組，推測中國新疆地區維吾爾族IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點CC基因型、C等位基因可能與IMN的進展密切相關，與郭玉等[7]研究結果相一致。

Hoxha等[15]研究發現，IMN患者PLA2R抗體水平與蛋白尿達到緩解的時間具有一定相關性，其是影響IMN緩解的一個獨立危險因素，可用于監測IMN的治療效果及預后。彭佳楠等[14]研究發現，中國寧夏地區攜帶PLA2R基因SNP rs35771982位點GG基因型的IMN患者較攜帶CG/CC基因型的患者完全/部分緩解率降低，且rs35771982位點GG基因型是IMN的獨立危險因素，其與疾病的預后相關。本研究發現，PLA2R基因SNP rs35771982位點CC基因型患者的完全/部分緩解率、復發率顯著低于GC、GG基因型患者，而GC、GG基因型患者的完全/部分緩解率、復發率差異無統計學意義，提示IMN患者攜帶PLA2R基因SNP rs35771982位點CC基因型可能不利于IMN疾病的治療，且預后較差，推測這可能與CC基因型影響PLA2R抗體水平相關。

目前，臨床上多使用免疫抑制劑治療IMN，雖然具有一定的臨床療效，但是環磷酰胺、他克莫司等免疫抑制劑帶來的不良反應幾乎難以避免。本研究發現，PLA2R基因SNP rs35771982位點CC基因型患者的血糖異常率GG基因型，尿酸異常率顯著高于GC、GG基因型，提示IMN患者攜帶CC基因型可能促進血糖、尿酸等不良反應的發生，降低治療療效和安全性，且預后較差。進一步通過logistic回歸分析發現，CC基因型是影響IMN患者不良預后的獨立危險因素，表明PLA2R基因SNP rs35771982位點CC基因型的存在提高了IMN治療的難度，并嚴重影響預后。

綜上所述，中國新疆地區維吾爾族IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位點的基因多態性可能與IMN治療效果及預后密切相關，并且rs35771982位點CC基因型是影響IMN患者不良預后的獨立危險因素。本研究局限于樣本含量相對較少，隨訪時間較短，PLA2R基因多態性對IMN患者治療效果及預后的影響及其機制還有待進一步深入研究。