Epstein-Barr病毒DNA在鼻咽癌臨床應用中的進展

鐘方炎，賴軍明，顧偉國，鄧劍雄，羅 輝，林 紅

(1.南昌大學第一附屬醫院腫瘤科，南昌330006; 2.義烏市中心醫院放射治療中心，浙江 義烏322000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽上皮的惡性腫瘤，在世界范圍內的分布具有明顯的種族和地域的差異，是我國華南地區常見的惡性腫瘤，每年的發病率為3/10萬[1]。目前其治療方式是以放療為主，再根據不同的臨床TNM分期結合化療。作為常規的分期手段，TNM分期指導著臨床治療并提示NPC的預后，但相同TNM分期的患者接受了同樣的治療方案，其療效也有很大的差異。隨著對NPC發生發展相關機制研究的不斷深入，研究者[2-3]認識到單獨TNM分期可能不足以準確詳細地指導NPC的治療及進行預后判斷，因此提出使用生物學標志物或許可以作為臨床分期的補充，從而更好地指導治療并判斷預后，其中EB病毒DNA(Epstein-Barr virus DNA，EBV-DNA)作為一種與NPC關系密切的生物學標記物已在相關研究中體現出其卓越的特異性和敏感度，并受到臨床工作者的認可。本文擬對EBV-DNA及EBV-DNA在鼻咽癌臨床應用中的進展作一綜述。

1 EBV-DNA是重要的生物學標志物

根據相關臨床資料[4-10]分析，NPC的預后因素可能包括性別、年齡、放化療方式、C-反應蛋白、血常規相關指標(白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白水平、血小板計數、紅細胞計數、血小板/淋巴細胞比率、中性粒細胞/淋巴細胞比率、淋巴細胞/單核細胞比率)、乳酸脫氫酶水平、白蛋白水平、體重指數、TNM分期。但上述指標僅反應了患者的營養狀況、免疫功能，具有普適性，與NPC之間的關聯程度有待考量，不具有很強的特異性。

EBV是皰疹病毒家族的一員，它已經被證實是多種疾病的病因，在NPC流行地區(病理類型以未分化型非角化癌為主)，患者均含有EBV基因組[11-12]。克隆EBV基因組存在于早期侵襲性病變或原位癌中，表明在惡性侵襲性腫瘤發展之前已有EBV感染[13]。目前認為EBV潛伏感染NPC細胞，并散在地產生病毒性裂解感染，EBV基因的表達僅限于EBNA1、LMP1、LMP2、EBERs和BART編碼的miRNA，而在這些基因中，LMP1是由EBV編碼的主要癌蛋白，其可以促進腫瘤的發生發展，促進細胞運動、侵襲和轉移，促進淋巴管生成，促進遺傳和表觀遺傳的改變[3]。EBV-DNA從腫瘤組織中脫落到血漿中,因此臨床上常檢測血漿EBV-DNA(pEBV-DNA)水平值來判定體內EBV的程度[14]。治療前和治療后持續高水平的pEBV-DNA與晚期疾病、腫瘤負荷、疾病復發和預后差有關[15-17]。NPC治療后血漿EBV特異性抗體水平下降或恒定提示預后較好，滴度的增加則強烈提示著預后不良[18]。在放療或NPC切除術中進行的動力學檢測表明，大多數患者在治療過程中可較早和迅速地清除EBV-DNA，隨后的任何增加都可能提示亞臨床疾病復發[19-20]。由于EBV-DNA在NPC中廣泛存在、與NPC發生發展密切相關，具有較強特異性和敏感性，可以提示NPC患者的預后并且方便易測，現已在臨床中廣泛應用。

2 EBV-DNA可作為無癥狀早期NPC患者篩查的工具

由于NPC的預后與腫瘤的臨床分期有很大關系，局限病灶的患者5年總體生存率(Overall survival,OS)可達到90%，但發生轉移的患者5年OS則低于50%[21]。而超過75%的患者在疾病發現時已經為局部晚期或者發生了轉移[21-22]。因此，通過篩查手段發現無癥狀的NPC患者將改善這種狀況。在CHAN等[23]的一項研究中，招募了1318名志愿者，并對他們進行EBV-DNA和病毒衣殼抗原IgA血清學監測，對持續陽性的患者重復監測并行鼻咽鏡及磁共振檢查，最后明確3名志愿者患有早期NPC。另一項約有20 174名接受EBV-DNA篩查的研究[24]中，1112名參與者可測得EBV-DNA，其中309名在重新檢測的樣品上測得有持續的陽性結果，并對其中的大部分參與者進行內鏡檢查和(或)磁共振檢查，最后確認34名參與者患有NPC；且通過篩查確定患有NPC的參與者中Ⅰ期或Ⅱ期疾病的比例明顯高于歷史隊列(71%比20%，P<0.001)。這提示EBV-DNA篩查作為一種無創的手段可使無癥狀早期NPC患者檢出率提升，有助于提升NPC患者的OS。但由于在其他疾病中也可檢測到EBV-DNA，這些疾病包括傳染性單核細胞增多癥、霍奇金病等[25-26]，所以在篩查NPC時也要注意患有這些疾病的可能。

3 EBV-DNA可監測治療后殘余疾病并提示疾病復發

TO等[19]研究發現，在進行手術切除腫瘤后，pEBV-DNA從血液循環中被迅速清除，平均半衰期只有139 min。CHAN等[27]的研究結果證實，循環中EBV-DNA多為200 bp以下的短片段，可以被人體降解，而腫瘤衍生的EBV-DNA正是裸DNA片段，并未與病毒顆粒結合，提示可測得的EBV-DNA是由腫瘤所產生。LO等[20]探索放療后pEBV-DNA的清除率，他們發現放療后患者的pEBV-DNA水平會立即出現激增，而這種快速的激增是由于死亡的NPC細胞中EBV-DNA的快速釋放，并且激增過后，pEBV-DNA水平降低，中位半衰期為3.8 d。因此，治療后因為腫瘤負荷的減少和人體正常的降解能力，EBV-DNA水平可以快速降低。而pEBV-DNA的下降率也被證明具有預后價值,與pEBV-DNA水平下降較慢的患者相比，下降較快的患者生存率更高[28-30]。由于EBV-DNA直接來源于NPC細胞，通過治療成功清除所有腫瘤細胞，有望徹底清除循環中的EBV-DNA。另一方面，經治療后，EBV-DNA在血漿中持續存在，提示體內存在殘余的腫瘤細胞。之后的一項研究[31]證實，治療后EBV-DNA水平對OS和無病生存率具有很強的預測作用,與較低及未檢測出EBV-DNA水平的患者相比,治療后EBV-DNA水平>500 copies·mL-1患者NPC復發的相對風險為11.9。這些結果通過對不同種族和臨床分期的患者的其他研究也得到了證實[32-34]。而一旦疾病復發或者轉移之后，5年的生存率將顯著下降。LEUNG等[30]進一步證明，與未檢測到EBV-DNA的患者相比，單純放療或同步放化療在整個過程的中位時間點可檢測到的pEBV-DNA水平與隨后的遠處轉移、OS和無病生存相關。通過pEBV-DNA水平分析識別出有殘余腫瘤或高復發風險的患者，并通過強化化療或其他治療來提升這些患者的OS，而pEBV-DNA檢測不出的患者則可減少不必要治療，避免治療相關的毒副作用，減少經濟負擔。

4 EBV-DNA結合TNM建立新分期模型指導臨床治療

一項針對NPC患者(n=57)血漿EBV-DNA定量研究結果顯示，pEBV-DNA水平在較晚分期(Ⅲ+Ⅳ期)比較早分期(Ⅰ+Ⅱ期)高4～10倍[14]。而后MA等[35]利用鼻咽磁共振成像發現血漿EBV-DNA水平與NPC腫瘤體積呈正相關。CHAN等[36]利用小鼠模型探索了NPC腫瘤負荷與血漿EBV-DNA水平的之間的關系，證明了人NPC異種移植的裸鼠pEBV-DNA水平與腫瘤質量呈線性關系。由于腫瘤負荷與血漿EBV-DNA的水平直接相關，因此EBV-DNA可用來推斷NPC患者的預后并指導治療。隨后有研究[22,32,37]進一步證明，與臨床分期相比，pEBV-DNA在預測患者總體生存期方面具有更強的預后價值。這些均提示將EBV-DNA分析納入NPC分期系統，建立新的分期模型可能能更好地判斷預后和指導臨床治療，而如何將兩者相結合形成新的分期模型已經受到眾多研究者關注。LEUNG等[22]嘗試將治療前pEBV-DNA水平與TNM分期相結合，制定新的分期模式用于評估治療前非轉移性NPC的預后。pEBV-DNA水平高低以4000 copies·mL-1為界，分成4組：第1組(Ⅰ+Ⅱ，低pEBV-DNA水平)、第2組(Ⅰ+Ⅱ，高pEBV-DNA水平)、第3組(Ⅲ+Ⅳ，低pEBV-DNA水平)、第4組(Ⅲ+Ⅳ，高pEBV-DNA水平)。4組患者的5年OS分別為91%、64%、66%、54%。

而后，ZHANG等[38]的一項回顧性研究結果顯示，治療前pEBV-DNA水平高低以4000 copies·mL-1為界，結果發現Ⅱ—Ⅲ期低pEBV-DNA水平患者與Ⅳa-b期(AJCC第7版)低pEBV-DNA水平患者5年OS分別為94.7%、92.9%(P=0.141)，Ⅱ—Ⅲ期高pEBV-DNA水平患者與Ⅳa-b期低pEBV-DNA水平患者5年OS為82.7%、92.9%(P=0.025)，Ⅱ—Ⅲ期高pEBV-DNA水平患者與Ⅳa-b期高pEBV-DNA水平患者5年OS為82.7%、71.7%(P=0.001)，因此研究者將患者分成4組：1)極低風險組：Ⅰ期，無論pEBV-DNA水平；2)低風險組：Ⅱ—Ⅳa-b期，低pEBV-DNA水平；3)中度風險組：Ⅱ—Ⅲ期，高pEBV-DNA水平；4)高風險組：Ⅳa-b期，高pEBV-DNA水平。

在2019年的ESMO ASIA會議上，CHAN等[39]進行的“鼻咽癌0502研究”中，根據數據建立新風險分組并進行驗證，將治療后pEBV-DNA水平分成4組，分別為0 copies·mL-1、1～49 copies·mL-1、50～499 copies、≥500 copies·mL-1，然后通過遞歸分割分析分3組：低危組(0 copies·mL-1和Ⅱ期/Ⅲ期，1～49 copies·mL-1和Ⅱ期)、中危組(0 copies·mL-1和ⅣAB期，1～49 copies·mL-1和Ⅲ/ⅣAB期)、高危組(50～499 copies·mL-1和Ⅱ期;高危組為50～499 copies·mL-1和Ⅲ/ⅣAB期，≥500 copies·mL-1和任何期)。并對單一TNM分期、單一pEBV-DNA水平和新風險分組進行一致性指數比較，數值分別為0.604、0.675、0.712，提示新風險分組準確度在3組中最高。

5 結語與展望

EBV-DNA的應用可使未來無癥狀及治療效果不佳的NPC患者較早被發現，并且使治療過程更加精準化。目前不同實驗室的EBV-DNA檢測技術水平差別很大，希望未來在實驗室設備，試劑材料，以及樣品收集、處理、結果報告等方面形成一套規范化體系。隨著EBV-DNA檢測技術精度提升和價格下降，或許其有望成為NPC早期篩查的常規手段。治療結束后患者復查主要依靠磁共振，而磁共振檢查在放療結束的早期由于炎癥、瘢痕等原因會產生假陰性結果，而未來EBV-DNA可以作為影像學檢查的補充，發現那些有殘余疾病或高危復發患者。未來根據新分期模型，風險較低患者可能可以減少后續不必要的治療，這將使得極大一部分患者能夠減輕經濟負擔，免受輔助化療或其他治療可能帶來的毒副反應，提高生活質量。并且明確風險較高的患者則需要輔助化療或者接受新的治療手段，以此來減少微轉移灶，降低復發率，提高生存率。