二代測序技術在骨髓增生異常綜合征基因突變檢測中的應用進展

王笑然，周虎，丁冰潔，劉建平，徐佩佩

（鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南 鄭州）

0 引言

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一種以造血細胞異常增生、外周血細胞減少和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)易感性為特征的克隆性血液學疾病。細胞遺傳學歷來在MDS 的診斷和預后中發揮重要作用，已有多個基因被發現與MDS 的疾病類型相關，而對這些基因突變的了解為定義的MDS 亞型提供了思路，同時也有助于開發治療MDS 的新療法。二代測序技術在MDS 診斷、預后和監測中的確切作用尚不清楚，本文將就二代測序技術在MDS 基因突變檢測中的應用進行介紹。

1 二代測序在MDS 診斷和分型中的應用

在2016 年修訂的2008 年WHO 指南中，對MDS 亞型進行了重新定義，強調了分化異常的細胞程度和百分比的地位。染色體核型信息的加入能使反應性細胞減少或細胞異常與真正的MDS 更容易區分。當患者出現原因不明的細胞減少癥和MDS 臨床表現一致，但不完全符合細胞形態學標準時，某些細胞遺傳學異常，如del(7q)、t(2;11)(p21;q23)可作為確診的依據。然而，并不是所有的MDS 病例都有可識別的核型異常。高達80%的復發MDS 患者都存在異常染色體核型，但不到50%的初診MDS 患者可檢測到核型異常。通過二代測序檢測基因突變有助于進一步區分MDS 亞型。伴環形鐵粒幼紅細胞增多的MDS 患者中，70%-80% 的病例中存在SF3B1 突變，盡管MDS 伴環形鐵粒幼紅細胞增多(MDSwithringsideroblasts, MDS-RS) 的診斷依據骨髓形態學中被要求為至少達到15%的環形鐵粒幼紅細胞，但在SF3B1突變的情況下，僅需要5% 的環形鐵粒幼紅細胞即可做出診斷。SF3B1 突變患者的臨床和形態學特征可能不同, 但SF3B1 與較低的骨髓細胞百分比、較高的中位血小板計數、較高的白細胞計數和較高的中性粒細胞計數之間存在相關性[1]。SF3B1 基因突變成為MDS 亞型的診斷依據，正是基因突變在MDS 診斷和分型中的重要臨床價值的體現,其他基因的突變狀態對MDS 的鑒別診斷也有一定的價值,目前在指南中作為推薦選做檢測項目, 包括TP53、TET2、DNMT3A、IDH1/2、EZH2、ASXLl、SRSF2、RUNXl、U2AFl、SETBPl 等。二代測序技術的應用，會使越來越多的基因突變在MDS 的診斷和分型中發揮重要作用。

2 二代測序在MDS 危險度分層中的應用

IPSS 和IPSS-R 是目前最廣泛使用的MDS 預后評分系統，但也有部分患者的預后與他們的風險評分不一致。其中一些差異可以用基因突變來解釋。例如，低風險的del(5q) MDS 患者傾向于對利那度胺有良好的反應，向AML 進展的更少，但高達20%的del(5q)患者在診斷時被發現存在TP53基因突變。一項針對944 名MDS 患者的大型研究發現了14 個具有預后意義的基因[2]。在這組基因中，TP53、ETV6、RUNX1、EZH 和ASXL1 的突變已被證實為不良預后的獨立預測因子。其他研究還發現，SRSF2 還可作為不良預后的獨立預測因子[3]。值得注意的是，將這些基因與傳統的IPSS-R模型相結合，能夠比僅基于IPSS-R 或僅基于突變的模型更準確地預測患者生存期[2]。當骨髓原始細胞低于5% 時，SRSF2、U2AF1 和ASXL1 突變與較短的生存期相關，但在較高的原始細胞負荷下卻無有價值的相關性[4]。將預后模型擴展到接受過多種治療的患者和繼發性MDS 患者也是一個重點。在建立了年齡、IPSS-R 評分、EZH2、SF3B1 和TP53突變與生存期的獨立相關性后，比單獨使用IPSS-R 更準確地預測患者的生存期。重要的是，該模型評估了初治和復發MDS 患者，并在接受多種治療的患者中得到了驗證。另一項針對亞洲原發性MDS 患者的研究，將5 個與較短生存期相關的獨立基因(DNMT3A、TP53、ASXL1、IDH2 和CBL)的突變狀態納入一個新的模型。在WHO2016 年分類組和IPSS-R類別中，具有這些突變的患者的生存期較短，與處于下一個高風險類別的患者具有明顯差異[5]。隨著越來越多的研究探索突變狀態在預后評分中的作用，如何調整IPSS-R 以納入基因信息和復合突變MDS 的生物學復雜性將變得更加清晰。

3 二代測序在MDS 治療中的應用

雖然許多新的治療方法正在研發中，但只有三種藥物——來那度胺、阿扎胞苷和地西他濱被食品和藥物管理局(FDA) 批準用于治療MDS，而且自2006 年以來沒有新的藥物被批準。無臨床表現及IPSS-R 評分較低的患者常常被忽略，直到他們因血細胞減少而出現癥狀或疾病發生進展才被診斷。低風險性貧血常通過輸血和促紅細胞生成素(erythropoiesis-stimulating agents，ESAs)來治療。疾病進展、伴del(5q)且對來那度胺耐受的患者，可以使用去甲基化藥物(DNMTIs)，如阿扎胞苷或地西他濱進行治療。異基因造血干細胞移植（Allo-HSCT）是唯一可治愈MDS 的方法，但大多數患者不符合移植條件[6]。

來那度胺可用于治療伴del(5q) 的MDS 患者，當伴有TP53 基因突變時可能預示著來那度胺治療失敗或進展為AML。將二代測序用于指導ESAs 的使用尚未得到充分的研究。在一項對79 例接受ESA 治療的低危MDS 患者研究中發現，最常見的基因突變是SF3B1、TET2、ASXL1 和DNMT3A，進行單因素分析發現，超過兩種突變與紅細胞反應性降低顯著相關，然而在多因素分析中則發現，突變的數量或類型與紅細胞反應性降低之間沒有明顯的相關性[7]。將二代測序用于指導去甲基化藥物應用值得探究。阿扎胞苷是首個通過隨機試驗明確對MDS 有效的藥物，但是只有一半的患者對該藥有反應[8]。有研究發現TET2 突變可以提高藥物反應率，而DNMT3A 突變與藥物不良應答之間存在相關性，但是沒有進一步的研究來支持這些結論[9]。然而，體細胞基因突變可以預測治療反應的持續時間，DNA 甲基化調節因子的突變和3 個或3 個以上突變的存在與去甲基化藥物反應時間的縮短有關。一項回顧性研究表明，TP53 突變患者對去甲基化藥物的應答時間明顯較短，大約為6 個月，但是該研究沒有發現基于TP53 突變狀態的總體應答率的差異[10]。相反,Welch 等[11]發現，在接受地西他濱治療的MDS/AML 患者中，TP53 突變的患者能夠更快的清楚骨髓異常原始細胞并且具有比預期更長的生存率, 但是這些結果只在21 例完全緩解率為19% 的TP53 突變患者中發現。其他關于TP53 突變患者對去甲基化藥物反應的研究并沒有一致證明地西他濱優于阿扎胞苷。因此，還需要進一步研究來明確TP53 突變對去甲基化藥物治療反應的影響。

基因突變狀態，尤其是TP53 的突變狀態，可能有助于預測Allo-HSCT 患者的預后[12]。雖然TP53、TET2、DNMT3A、RUNX1 和ASXL1 的突變被認為是Allo-HSCT 后生存期縮短的指標，但TP53 是唯一一個獨立的預測因子，可以預測各組間的生存期縮短。而在MDS/MPN 中，RAS 途徑突變可以預測到較短的生存期，RAS 途徑突變和TP53 突變均與Allo-HSCT 后復發時間較短有關。根據對797 例MDS 移植患者的研究發現，移植患者TP53 突變的不良預后可能與復雜核型有關，與復雜核型患者相比，無復雜核型的TP53 突變患者移植后生存期顯著延長。但是目前仍不清楚這是否與患者的非復發死亡率相關。二代測序可能有助于監測疾病殘余和預測移植后的復發。與其他研究一樣，RAS 途徑、RUNX1和ASXL1 的突變與Allo-HSCT 后的死亡風險沒有顯著相關性。此外，這些基因的突變與移植后疾病進展的風險之間沒有顯著的聯系。持續存在的突變可能與移植效果差有關的觀點有待進一步驗證。

4 存在的問題及未來展望

在MDS 中通常發生突變的基因并不是MDS 特有的。例如，TET2 和DNMT3A 的體細胞突變可以在所有的髓系腫瘤和淋系疾病中看到，SF3B1 的突變也可以在骨髓增殖性腫瘤（MPN）和慢性淋巴細胞白血病中看到。此外，在健康人群中也可發現細胞突變。研究報告顯示，高達79%的MDS 患者在NGS 靶板上發現突變,二代測序具有巨大的潛力，可以幫助臨床醫生在觀察突變頻率、治療藥物的選擇、其他合并癥的評估以及評估預后的能力等方面做出決策。隨著二代測序技術的不斷進步，MDS 基因突變的種類被發現的越來越多，對預后和疾病的分類有著巨大的貢獻。對這些突變的了解為靶向治療的研發提供了依據和思路，利用二代測序來檢測變異頻率低的等位基因突變，可以針對這些遺傳缺陷來進行治療。然后，對二代測序結果的解讀也是一個挑戰，不同的突變基因有著不同的突變位點和類型，這些在疾病的診斷和治療中是否有一定影響尚待進一步明確。標準化二代測序方法和變量調節，以提高數據的完整性也是二代測序在MDS檢測中的重要挑戰。