生長分化因子在椎間盤退行性病變中的研究進展

楊榮，趙剛

(昆明醫科大學第二附屬醫院創傷外科，云南 昆明)

0 引言

腰痛是椎間盤退變患者最常見的就診原因，也是影響生活和工作的重要因素[1]。盡管導致腰痛的原因復雜繁多，但椎間盤(IVD)退變早已被證實為主要病因[2，3，4]。IVD 是位于椎體間的纖維軟骨組織，約占脊柱總長度的1/3[5]。椎間盤具有增大脊柱運動幅度、承受壓力、緩沖震動、保護大腦和脊髓的作用[6]。IVD 變性是由細胞驅動的髓核細胞退變、髓核細胞外基質退變、軟骨終板和纖維環退變，其中最主要的是髓核細胞的減少與細胞外基質改變，導致髓核(NP)和纖維環(AF)機械故障，AF 進行性破裂，最終導致NP 突出，這一過程同時伴隨著血管的生長和刺激性神經纖維進入炎癥椎間盤，進而使免疫細胞浸潤，伴發疼痛。IVD 變性可因過度的體力勞動、潛在的遺傳因素和衰老而加劇[7,8]。目前的治療方案有限，主要以緩解疼痛癥狀為主，而不是糾正病理改變。治療上包括保守治療和手術治療。保守治療包括服用止痛藥物及抗炎藥物、理療等。其次是手術治療，手術治療是保守治療無效的最終方法，但是椎間盤摘除、脊柱融合等手術成本高，其治療結局并不十分令人滿意，而且容易加速鄰近節段退變。生物治療旨在恢復IVD 穩態并使受損組織再生，主要是恢復NP 和AF 組織的結構和功能。因此，生物療法在臨床前研究中展現出了前景，生物療法包括生物分子療法、細胞療法、組織工程方法。生物分子療法是通過誘導細胞減少分解因子，或者增加合成因子，從而促使細胞外基質再生。生物分子和基因療法能夠在蛋白和基因水平改變細胞生物合成，其中一類因子—生長分化因子( GDFs )具有關鍵作用，包括促進NP 細胞的分化和維持軟骨組織穩態[9-12]。因此本文重點關注GDF 家族對IVD 修復再生的潛在治療作用。

1 椎間盤(IVD)的結構、功能及退變

椎間盤(IVD)包括三個部分：髓核(NP)、纖維環(AF)和軟骨終板( CEPs )，構成人體中最大的無血管結構。IVD 的性質和功能取決于其特定的微結構，而這些微結構又由不同的細胞群體產生。NP是一種富含陰離子蛋白多糖的細胞外基質，以聚糖為主，它們以27：1 的比例(聚糖：膠原) 排列在不規則的Ⅱ型膠原網中[13-17]。陰離子蛋白多糖分子的高密度特性能夠吸引并保留水分，使NP 能夠抵抗壓力載荷。NP 由AF 包圍，纖維環由外、中、內三層呈同心圓排列的纖維構成，纖維環中外層纖維緊密地附著于兩個椎體的垢環之間，內層纖維連于上下軟骨終板上，纖維環2/3 由膠原組成[18-20]。AF 外層95 %以上為Ⅰ型膠原蛋白，在靠近NP 的部分Ⅰ型膠原蛋白數量幾乎呈線性降下至5 %以下。CEPs 固定并維持NP 和AF 的位置和形狀，并且充當半透膜屏障，支持營養物質和液體交換[21-24]。

椎間盤變性時，NP 細胞合成的Ⅱ型膠原逐漸被Ⅰ型膠原取代，蛋白多糖合成減少，導致NP 與AF 的界限不清。蛋白多糖含量是維持NP 正常功能的重點，軟骨細胞產生的蛋白多糖與膠原的比值比髓核細胞低[25]。椎間盤退變時髓核缺乏保水性導致圓盤高度降低，從而失去將脊柱應力均勻分布到纖維環的能力，從而產生高壓區。退行性NP 和AF 產生許多促炎細胞因子，包括白細胞介素( IL )、干擾素( IFN ) 、腫瘤壞死因子α ( TNF-α )和前列腺素E2 ，這些趨化因子誘導免疫細胞作用于退行性IVD，從而引發了NP 和AF 細胞的一系列病理反應，包括NP 標記基因失調，以及引發自噬、衰老和凋亡等反應[26-28]。同時退行性NP 和AF 細胞增加了基質降解酶的表達，加速了Ⅱ型膠原和富含蛋白多糖的ECM 的丟失。對于椎間盤，特別是髓核再生治療的重點是阻止退變進程、恢復正常ECM 生成、逆轉分解代謝進程以及減少炎癥反應。

2 當前椎間盤退變治療和再生治療的進展

保守治療椎間盤退變可促進輕度退變的椎間盤自我修復，這些療法可以改善患者的生活質量，但并不能阻止IVD 退變進程。當保守治療失敗時，手術作為最終選擇，在已發生IVD 突出的地方行椎間盤切除仍是手術的金標準，脊柱融合得到了廣泛的應用[29]。盡管短期內效果良好，但是由于所有手術過程都是有創且不可逆轉的，術后可能出現手術相關并發癥，如脊柱的應力改變，脊柱融合可能導致鄰近融合部位的IVDs 加速退變[30]。

總之，目前可用的手術治療方案缺乏在必要的細胞和分子水平上中止和糾正IVD 退變級聯反應和炎癥環境的能力。分子生物學和生物材料學的進步使IVD 再生療法變得切實可行。隨著對IVD 生理學以及退變病理學的認識不斷提高，人們提出的與之相關的治療方案和分子靶點的數量也不斷增加，包括細胞材料和脫細胞生物材料植入、基于信號蛋白的轉化生長因子和基因療法等。目前臨床上最簡單、最經濟的方法是向局部注入生物活性分子，如生長因子、形態發生因子、抗代謝因子、小分子抑制劑、細胞因子或趨化因子等[31]。然而，由于生物活性因子復合物潛在的可變性和不可預測性，目前的研究主要集中在尋找具有治療潛力的單一生物分子上，最常用的候選分子是抗分解/合成代謝蛋白，其目的是恢復IVD 的穩態，特別是恢復NP 的代謝平衡[32]。GDF 家族成員(包括GDF5(BMP14，CDMP-1)、GDF6(BMP-13，CDMP-2)和GDF7(BMP-12))可能是IVD 再生的理想分子。GDF 不僅促進IVD 細胞中ECM 基因合成代謝表達，而且在IVD 的發育和穩態中具關鍵作用。

3 IVD 發育中的生長分化因子、穩態和再生潛力

生長分化因子最早從牛的軟骨中發現，是骨形態發生蛋白(BMP) 家族的成員。GDF 家族成員之間氨基酸同源性為80-86%，與BMP 家族同源性在50% 左右[33,34]。BMP 家族成員在蛋白質結構和氨基酸序列相似性的基礎上，又細分為BMP2/4 組、BMP-5/6/7/8 組、BMP-9/10 組和GDF5/6/7 組。雖然大多數BMP成員如BMP-2/4、BMP-7 和BMP-9/10 等均表現出較強的骨誘導活性，但GDF5/6/7 主要誘導軟骨、肌腱和韌帶樣組織生成[35]。與其他BMP 家族成員一樣，GDF 信號通過含有I 型和II 型受體的跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體多聚體傳導。GDF5 和GDF6 通過Ⅰ型受體BMPR-1A 和-1B 及Ⅱ型受體BMPR2、ACVRIIA 和ACVRIIB 起作用[36,37]，除此之外這些途徑還與炎性細胞因子信號傳導相關。最近的證據表明GDFs 也能激活這些非Smad 途徑，特別是Erk1/2[38]，這些非經典BMP 受體提供了諸如GDF6 因子的合成和分解代謝信號傳導途徑，這是IVD 變性的特征之一。GDFs與促炎分子的這種潛在的相互作用表明了退變過程中存在著調控失調。在體外，GDF6 增加NP 退化細胞產生ECM，而在體內GDF6 可以阻止羊模型中的ECM 降解[39]。在小鼠模型中，過表達人GDF6 可使炎癥因子的血漿水平下降[40]。

最近的一篇研究表明GDF6 是骨髓間充質干細胞(MSCs )分泌的抗衰老因子，其表達受到miR-17 的調控，miR-17 是一種隨年齡而下降的microRNA[41]，這可能對與衰老過程密切相關的IVD 變性進展具有重要意義。最近人們對GDF6 在人胎兒脊柱發育中的表達及定位進行了研究。GDF6 的強表達尤其表現在發育早期(孕8-13周)和發育中期(孕8-19 周)的IVDs 軟骨區域中。GDF6 表達定位在NP 和內AF，但免疫組織化學染色未能在外AF 中檢測到[12]。在成年人中，GDF5 和GDF6 在內、外AF 中均可檢出，但在NP 中表達最強烈[42]，這表明GDF 家族對合成代謝基因表達具有重要性。

4 GDFs 在體內對IVD 再生和傳遞方式的影響

GDFs 除了驅動細胞分化外，還能促進IVD 細胞的合成代謝，特別是對NP 細胞和體外軟骨細胞。這表明GDF 在正常IVD 中具有保護作用，而在退變性椎間盤中可能失調。在已報道的體外培養中，GDF5 和GDF6 對細胞有相似的作用，在培養物中重組GDF5誘導人NP 細胞產生更多II 型膠原和蛋白多糖[42]，在小鼠IVD 細胞、牛NP 和AF 細胞培養中GDF5 同樣有劑量正相關性。在牛細胞培養中GDF5 都使AF 和NP 細胞的蛋白多糖和膠原蛋白生成增加，但NP 細胞反應更強烈，尤其在蛋白多糖產生方面[43,44]。

Zhang 等通過腺病毒介導的過表達研究了不同BMP 家族分子對牛AF 細胞外基質生成的影響，發現GDF6 過表達誘導生成較多蛋白多糖和膠原[45]。在人NP 和AF 細胞的3D 藻酸鹽珠培養中添加GDF6 同樣增加了蛋白多糖和膠原數量[46,47]。這一結果支持GDF6 同樣可以作為軟骨細胞趨化劑。綜合來看，這些結果說明GDF5 和GDF6 在NP 和AF 細胞合成代謝中具有直接的信號傳導作用，這種作用對正常的NP 細胞ECM 影響最大。

5 體外補充GDFs 對椎間盤細胞和軟骨細胞的影響

許多生長因子被作為間充質干細胞(MSCs)NP 樣分化的誘導劑，包括TGFβ、IGF-1、FGF-2 和PDGF[48,49]。然而，這些研究關注的是一般軟骨形成標記物，而不是與NP 分化特定相關的標記物。GDF5 和GDF6 被證明可誘導軟骨形成基因的表達，更重要的是還可誘導NP 特異性基因表達。當GDF5 作為MSCs 或脂肪干細胞(ASCs)高濃度培養基的添加劑時，軟骨分化增加，這對于髓核來說是不可取的。然而，在研究NP 細胞的報道中存在類似GDF5 反應的證據有限，這意味著目前在干細胞群體中觀察到的這種反應對于GDF5 直接應用于退行性椎間盤的意義尚不清楚，需要進一步的體外和體內研究。

在比較研究中，GDF6 在人間充質干細胞(MSCs)和脂肪干細胞(ASCs) 中均比GDF5 促進更多的NP- 標記物基因表達[50,51]，誘導產生更多蛋白多糖，細胞外基質蛋白多糖是正常髓核所必需的。Nochi 等[52]利用腺病毒介導的GDF6 構建間充質祖細胞(C3H10T1/2 細胞)的研究進一步支持這一發現，在使用GDF6時減弱了軟骨內骨化的進展，增強了NP 標記物的表達、增加了蛋白多糖的生成，同時觀察到比GDF5 更高的糖蛋白/ Ⅱ型膠原比例，有力地說明GDF6 是最有希望從MSCs 或ASCs 中植入NP 細胞表型的候選物。

6 結論與展望

生物分子療法治療退行性椎間盤疾病的前景廣闊，在生物分子療法中選擇正確的生物活性分子和治療靶點至關重要。GDF 家族成員無論是作為直接的趨化因子傳遞給NP 細胞，還是作為NP特異性分化的誘導因子傳遞給MSCs 或ASCs，都表現出了巨大的前景。無論在哪種情況下，GDF6 均可促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖生成增加，并增強NP 特異性標記基因的表達。今后的研究應更深入研究生長分化因子在椎間盤中傳導、控制和釋放機制。GDF與細胞治療的結合應用值得關注，目前人們正在努力尋找治療的最佳細胞群。由于退行性IVD 的促炎環境與非經典GDF 細胞因子信號傳導通路的趨同性，需要進一步研究它們之間的相互作用，可能從中找到新的治療靶點，從而優化GDF 治療。