阿爾茨海默病秀麗隱形桿線蟲(chóng)Aβ 模型的建立

王饒瓊，王立勝，白雪，李雙陽(yáng)

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州)

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，又稱(chēng)老年癡呆，是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，目前已經(jīng)成為第三大致死性老齡化疾病[1]。AD 逐年升高的發(fā)病率，使得傳統(tǒng)治療藥物無(wú)法滿足患者的需求，新療法、新藥物亟待被研究[2]。缺乏合適的動(dòng)物研究平臺(tái)是神經(jīng)退行性疾病研究受到阻礙的主要因素之一[3]。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans，C.elegans) 作為一種新型模式生物以其花費(fèi)少、生命周期短、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，逐步取代傳統(tǒng)動(dòng)物模型在神經(jīng)系統(tǒng)研究領(lǐng)域發(fā)揮作用[4]。現(xiàn)階段已被建立的阿爾茨海默病秀麗隱桿線蟲(chóng)模型多為轉(zhuǎn)基因模型：Aβ 模型和tau 模型[5]，本文章主要研究阿爾茨海默病秀麗隱桿線蟲(chóng)Aβ 模型的建立。

1 A 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C.elegans(N2) 野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)120 條、E.coli OP5O，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院國(guó)際中葡研究中心提供。隨機(jī)分為空白組和實(shí)驗(yàn)組各60 條，實(shí)驗(yàn)組建立Aβ 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)模型，空白組建立無(wú)Aβ 表達(dá)的線蟲(chóng)模型。

1.2 線蟲(chóng)的培養(yǎng)與保存

大腸桿菌OP50 的凍存菌種接種于LB 液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)，用接種環(huán)蘸在培養(yǎng)基表面劃線，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-14h；挑取一個(gè)LB 固體培養(yǎng)基上的單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩器中，37℃，150rpm，培養(yǎng)12h；凝固后NGM 培養(yǎng)基均勻涂布OP50 菌液，置于37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。將從-80℃冰箱中取出的凍存線蟲(chóng)，短時(shí)間快速融化后，用高速離心機(jī)離心去除上清，用無(wú)菌的M9 緩沖液重懸蟲(chóng)體后轉(zhuǎn)移到新的涂有OP50 菌苔的NGM 平板，將復(fù)蘇后的線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新的NGM 平板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 模型的建立

1.3.1 建立Aβ1-42 嵌合轉(zhuǎn)基因

β-(1-42) 肽編碼基因分為三個(gè)步驟。矢量ppd50.52 人工信號(hào)肽編碼序列的引物擴(kuò)增，采用SP-up (5'-CGGGATTGGCCAAAGGACCC-3')and SP-down(5'-CCCGGTACCTGCTGGTGCCAGAAAGAT-3')，裂 解Nhe I 和Kpn I 限 制 性 內(nèi) 切 酶，并插入NheI 和KpnI 之間的獨(dú)特位點(diǎn)矢量pPD49.26，從而構(gòu)建pCL2。這個(gè)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一個(gè)重組的信號(hào)肽。通過(guò)利用引物β1-42-up(5'-GGGGGTACCGATGCAGAATTCCGACATGA-3') 和β1-42-down(5’- CCCGAGCTCACGCTATGACAA—CACCGCCAA-3')，從人類(lèi)的Aβ 淀粉樣前體蛋白cDNA 的克隆p4t4b(29) 擴(kuò)增產(chǎn)生146 bp 的片段編碼β-(1-42)( 包括人工終止密碼子)，裂解Kpn I和Sac I，并插入獨(dú)特的Kpn I 和Sac I 位點(diǎn)pCL2，產(chǎn)生pCL3。信號(hào)肽/ β-(1-42)微基因片段通過(guò)與Nhe I 和Sac I 分解從該質(zhì)粒中移除，插入Kpn I 和Sac I 之間獨(dú)特位點(diǎn)矢量pPD30.38，從而構(gòu)建pCL12。β-(1-42)的序列微基因經(jīng)雙脫氧測(cè)序確定(唯一的編碼鏈)。

1.3.2 顯微鏡注射法將性腺引入線蟲(chóng)

轉(zhuǎn)基因是由顯微注射性腺導(dǎo)入線蟲(chóng)。標(biāo)記質(zhì)粒PRF4 [rol-6(su 1006)] 和上述的結(jié)構(gòu)( 每個(gè)質(zhì)粒at ≈100ng/ul) 被注射進(jìn)him-5(el490) 的動(dòng)物，恢復(fù)Roller 轉(zhuǎn)基因后代。通過(guò)選擇Roller 標(biāo)記表型來(lái)建立和維持傳輸線。一個(gè)66 銫源的包含有7000rad(1rad= 0.01Gy)γ 射線的染色體外基因陣列的照射線，可以使含有染色體整合的轉(zhuǎn)基因菌株恢復(fù)，然后通過(guò)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的100%透光率對(duì)輻照動(dòng)物后代進(jìn)行篩選。最后對(duì)大量公認(rèn)的整合線進(jìn)行免疫組化，證實(shí)嵌合結(jié)構(gòu)的完全透過(guò)率。

1.4 模型的檢測(cè)

1.4.1 躲避反應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

連續(xù)3 天同一時(shí)間予以身體輕觸、鼻尖輕觸、身體重?fù)粢约芭囵B(yǎng)基震動(dòng)，觀察線蟲(chóng)躲避反應(yīng)；3 天后撤出刺激。

1.4.2 溫度感知記憶實(shí)驗(yàn)

將空白組與對(duì)照組的線蟲(chóng)在20℃放在有和無(wú)食物的環(huán)境下分別培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到有15℃、20℃、25℃不同溫度梯度培養(yǎng)皿中時(shí)，對(duì)比線蟲(chóng)在不同溫度梯度的等溫線上的分布情況；每隔2h 做一次計(jì)數(shù)觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：本實(shí)驗(yàn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0，定量資料用表示；各組組間的比較，用單因素方差分析；每組組間的兩兩比較，用LSD(least significance of difference，最小差異顯著法)法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 躲避反應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組：前三天刺激線蟲(chóng)身體后半部分會(huì)使它們加速向前運(yùn)動(dòng)，反之刺激其身體前半部分，它們會(huì)產(chǎn)生后退運(yùn)動(dòng)；敲擊培養(yǎng)基、鼻尖輕觸線蟲(chóng)會(huì)反向運(yùn)動(dòng)或者后退；3 天后，撤出刺激，同一時(shí)間53 條線蟲(chóng)出現(xiàn)同樣運(yùn)動(dòng)改變；空白組線蟲(chóng)前后均無(wú)運(yùn)動(dòng)改變；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 溫度感知記憶實(shí)驗(yàn)

2.2.1 有食物培養(yǎng)的線蟲(chóng)

實(shí)驗(yàn)組54 條線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到20℃的溫度分布線上，4 條轉(zhuǎn)移到15℃的溫度分布線上，2 條轉(zhuǎn)移到25℃的溫度分布線上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；空白組17 條轉(zhuǎn)移到15℃的溫度分布線上，20 條轉(zhuǎn)移到20℃的溫度分布線上，23 條轉(zhuǎn)移到25℃的溫度分布線上，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組與空白組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2.2 無(wú)食物培養(yǎng)線蟲(chóng)

實(shí)驗(yàn)組線蟲(chóng)30 條轉(zhuǎn)移到15℃溫度分布線上，29 條轉(zhuǎn)移到25℃的溫度分布線上，1 條轉(zhuǎn)移到20℃的溫度分布線上，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；空白組無(wú)明顯變化，但與實(shí)驗(yàn)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

阿爾茨海默病是是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)病于老年人。其主要特征表現(xiàn)為記憶能力的減弱、認(rèn)知能力的逐步下降以及行為障礙[6]。主要的病理學(xué)特征是大腦局部尤其是海馬和皮層神經(jīng)元退行性病變，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和細(xì)胞外老年斑沉淀[7]。其中β 淀粉樣蛋白(Aβ)為沉淀的主要成分，是由β 前體蛋白(APP)通過(guò)蛋白酶形成的多肽片段途徑裂解成長(zhǎng)度為39-43個(gè)氨基酸的片段[8]。淀粉樣前體蛋白APP 存在于包括神經(jīng)原纖維在內(nèi)的多種細(xì)胞膜表面，是一類(lèi)具有膜受體蛋白樣結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，APP 蛋白經(jīng)β-γ-分泌酶水解后在大腦中產(chǎn)生兩種主要成分，名為Aβ-40 和Aβ-42 的蛋白小片段。其中Aβ-40 較Aβ-42有更為顯著的可溶性，因此，Aβ-42 是作為淀粉樣蛋白斑的主要成分[9]。Aβ 單體在體外聚合形成不溶性的蛋白聚合物，沉積于神經(jīng)元表面，破壞了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，引發(fā)神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少，大量神經(jīng)元和軸突功能失調(diào)，最終導(dǎo)致AD 癥的發(fā)生[10]。由于秀麗隱桿線蟲(chóng)中不存在β-分泌物的類(lèi)似基因，轉(zhuǎn)入人的APP 基因后不能自行產(chǎn)生Aβ，故目前建立的模型主要是轉(zhuǎn)Aβ 基因模型[11]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)是從土壤中分離的一類(lèi)無(wú)毒無(wú)害，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可以獨(dú)立生存的小型線蟲(chóng)。秀麗隱桿線蟲(chóng)培養(yǎng)簡(jiǎn)單，在實(shí)驗(yàn)室條件只需要配置NGM 平板，喂食大腸桿菌OP50 就可以保證其生長(zhǎng)發(fā)育[12]。它在神經(jīng)生物學(xué)的研究方面，線蟲(chóng)也是一個(gè)不可替代的真核生物模型，擁有簡(jiǎn)單完整的神經(jīng)系統(tǒng)[13]。其感受系統(tǒng)不僅能檢測(cè)到食物、宿主、配偶的存在，還能幫助其及時(shí)發(fā)現(xiàn)并躲避危險(xiǎn)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將線蟲(chóng)在20℃的環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)把它們轉(zhuǎn)移到不同溫度梯度的環(huán)境中時(shí)，它們趨向于分布到其培養(yǎng)條件的溫度環(huán)境。并且，將線蟲(chóng)在一個(gè)溫度中饑餓一段時(shí)間后放置到溫度梯度中時(shí)，它們則會(huì)避開(kāi)饑餓時(shí)的溫度。并且觸覺(jué)等刺激也可以引發(fā)線蟲(chóng)的躲避行為。表明，線蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)雖然相對(duì)簡(jiǎn)單，但卻對(duì)溫度、機(jī)械、化學(xué)等外界刺激具有靈敏的感知、反應(yīng)與記憶能力。

綜上所述，可以通過(guò)線蟲(chóng)Aβ1-42 轉(zhuǎn)基因，建立阿爾茨海默病秀麗隱形桿線蟲(chóng)Aβ 模型。，為后期阿爾茨海默病的研究和新藥開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)，對(duì)理解神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律和盡早干預(yù)具有重要意義。