外周血NK及NKG2C+NK細胞比例變化與復發性流產的關系

劉倩，侯悅，金大中，喬寵

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004；2.遼寧省母胎醫學重點實驗室，遼寧 本溪 117000；3.遼寧省高校婦產科重點實驗室，遼寧 本溪 117000）

我國將3次及3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失稱為復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA），但《復發性流產專家共識》［1］中指出連續發生2次流產即應重視并予評估，因其再次出現流產的風險與3次者相近。RSA病因復雜，約半數患者存在免疫功能紊亂，自然殺傷（natural killer，NK）細胞數量、功能及表面受體的表達被認為與RSA的發生密切相關［2-3］。NKG2C作為NK細胞的活化性受體，激活后可引起細胞殺傷能力升高，從而對腫瘤細胞及感染起抑制作用［4-5］，目前尚未見其在RSA中的研究。本研究擬通過流式細胞術檢測RSA患者外周血NK及NKG2C+NK細胞百分比變化，探討NK細胞及其受體NKG2C與RSA的相關性，為RSA的免疫學機制研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年9月至2019年11月就診于中國醫科大學附屬盛京醫院產科門診的早孕期RSA患者（57例）及孕6～12周正常孕婦（30例，正常對照組）。將RSA患者根據此次妊娠胚胎是否丟失分為RSA流產組（15例）與RSA妊娠組（42例）。RSA流產組年齡 24～41歲，體質量指數20.83～30.30 kg/m2，流產時孕 6～12周；RSA妊娠組年齡22～43歲，體質量指數16.02～30.11 kg/m2；對照組年齡22～41歲，體質量指數17.81～31.25 kg/m2。3組年齡、體質量指數、孕周均無統計學差異，具有可比性，見表1。

RSA組納入標準為與同一性伴侶于20周前連續發生≥2次的自然流產，排除雙方存在染色體數目或結構異常可能導致的流產，排除女方存在生殖器官解剖異常及生殖道炎癥，排除慢性高血壓、心臟病、內分泌異常、自身免疫性疾病、病毒感染等因素引起的流產；正常對照組納入標準為既往無自然流產史及異常生育史，此次妊娠無異常陰道流血，超聲提示正常宮內妊娠，可探及妊娠囊及胎心，胎芽與孕周相符，未見宮腔積液，既往健康無任何基礎疾病。3組患者均于早孕期門診就診時抽取肘靜脈血。本研究已獲得研究對象知情同意，并獲得中國醫科大學附屬盛盛京醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

表1 3組一般資料（）Tab.1 General data of three groups（）

表1 3組一般資料（）Tab.1 General data of three groups（）

BMI，body mass index.

1.2.1 儀器與試劑：FACS Calibur流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；PerCP/Cy5.5-CD3（批號317336，美國Biolegend公司）；FITC-CD56（批號562794，美國BD公司）；PE-CY7-CD16（批號557744，美國BD公司）；APC-NKG2C（批號FAB138A，美國R&D公司）；溶血素（批號5154719，美國BD公司）。

1.2.2 流式細胞術：用EDTA抗凝管采集研究對象外周血，暫存于4 ℃待檢。在流式管中加入混合單克隆熒光抗體（包括PerCP-Cy5.5-CD3抗體、FITCCD56抗 體、PE-CY7-CD16抗體、APC-NKG2C抗體），吸取抗凝管內外周血100 μL加入流式管振蕩混勻，避光孵育15 min后，加入1 mL紅細胞裂解液，振蕩混勻裂解10 min，PBS洗滌2次，加入300 μL PBS溶液重懸震蕩，采用FACS Calibur流式細胞儀檢測。用流式數據分析軟件flowjo-v10分析外周血流式數據，結果以陽性率（%）表示。本研究用CD3、CD56、CD16進行外周血NK細胞的圈門實驗，首先根據前向角、側向角來確定淋巴細胞區域，再根據CD3-CD56+確定NK細胞大致區域，根據CD56表達強弱及CD16分為CD56brightCD16-及CD56dimCD16+亞群，見圖1。

圖1 外周血NK細胞圈門策略Fig.1 Peripheral blood NK cell gating strategy

1.3 統計學分析

2 結果

RSA流產組總NK細胞百分比顯著高于RSA妊娠組及正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；RSA流產組NK細胞CD56dimCD16+亞群雖高于RSA妊娠組及正常對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；RSA流產組NK細胞CD56brightCD16-亞群低于RSA妊娠組及正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；RSA流產組NKG2C+NK細胞百分比較RSA妊娠組及正常對照組顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

NK細胞是人體的固有免疫細胞，在機體遇到外來刺激時無需抗原刺激即可發揮免疫作用［6］。人類NK細胞根據表面標志可分為CD56dimCD16+及CD56brightCD16-亞群［7］，外周血中約90%的NK細胞為CD56dimCD16+表型，行使免疫監視與免疫殺傷作用，而僅有不足10%的NK細胞為CD56brightCD16-表型，通過分泌細胞因子行使免疫營養與免疫保護作用。目前，國內外關于外周血NK細胞數量改變與RSA之間聯系的相關研究結果具有較大爭議，大部分研究［8-9］發現RSA患者總NK細胞數量較正常孕婦高，但也有研究認為NK細胞在RSA中的作用主要體現在細胞功能上，而不是體現在細胞總數上。目前關于NK細胞亞群CD56dimCD16+、CD56brightCD16-與RSA之間關系的研究較少。本研究發現，RSA流產患者外周血總NK細胞數量明顯高于RSA妊娠患者（P＜0.05），與正常早孕期孕婦相比，雖然數值較高但無統計學差異，而RSA妊娠患者外周血總NK細胞數量與正常早孕期孕婦相比稍低（P＞0.05）。KING等［8］也發現RSA流產患者外周血總NK細胞數量高于正常妊娠組，與本研究結果一致。本研究還發現，RSA患者若此次早孕期未發生自然流產，其外周血NK細胞數量將保持較低水平，甚至略低于正常早孕期孕婦。說明RSA患者自然流產的發生與NK細胞數量增加關系密切，通過改變NK細胞的數量，也許能夠避免NK細胞增多型RSA患者繼續發生自然流產事件。本研究還對NK細胞CD56dimCD16+及CD56brightCD16-細胞亞群進行了比較，發現RSA流產患者外周血CD56dimCD16+NK細胞比例高于RSA妊娠患者及正常早孕期孕婦，但差異無統計學意義。CD56dimCD16+NK細胞在外周血中發揮細胞殺傷毒性作用，其比例增高說明外周血NK細胞殺傷功能是RSA患者發生自然流產的重要因素，KARAMI等［10］也發現CD56dimNK細胞比例在RSA及人工授精失敗患者中增高，與本研究結果一致。但由于本研究中納入的RSA流產患者較少，故未能發現顯著的統計學差異。本研究還發現，RSA妊娠患者外周血CD56brightCD16-NK細胞比例明顯高于正常早孕期孕婦。CD56brightCD16-NK細胞約占外周血NK細胞的不足10%，主要分布在蛻膜組織中，占蛻膜NK細胞的70%左右。研究［11］發現，蛻膜CD56brightCD16-NK細胞可分泌大量細胞因子，促進滋養細胞侵襲及血管重塑，對成功妊娠發揮積極作用。本研究證實了外周血中CD56brightCD16-NK細胞對RSA患者成功妊娠的積極作用。PARK等［7］認為外周血NK細胞能反映蛻膜NK細胞水平的變化，是預測妊娠結局的有效指標，但外周血CD56brightCD16-NK細胞增多是否會促進蛻膜CD56brightCD16-NK細胞的募集目前僅是一種猜測，需要進一步研究。本研究中，為了更深入探討NK細胞受體與RSA的相關性，對NK細胞的活化性受體NKG2C進行了比較分析，結果發現RSA流產患者NKG2C+NK細胞比例顯著高于RSA妊娠患者與正常早孕期孕婦（P＜0.05），提示外周血中NKG2C+NK對成功妊娠是不利因素。目前國內外關于NKG2C+NK與妊娠關系的研究較少，羅方媛等［12］研究發現重度子癇前期患者蛻膜NK細胞激活性受體NKG2C+NK的表達水平增加，推測其表達增高可能導致NK細胞殺傷能力增強，從而影響滋養細胞的浸潤能力，導致子癇前期的發病。RSA與子癇前期的發病機制相似，在RSA患者外周血中發現了相同的表達趨勢，需進一步探究其具體作用機制。

表2 3組NK細胞及NKG2C+NK細胞比例比較（%）Tab.2 NK cells and NKG2C+NK cells ratios of three groups（%）

綜上所述，本研究結果提示，RSA患者外周血NK細胞百分比變化及NKG2C+NK細胞增多可能導致免疫平衡失調，引起自然流產，對于NK細胞數量較高的RSA患者可以嘗試針對性的免疫治療方案。本研究還存在一定的局限性，有待進一步擴大樣本量進行比較分析。