f101基因3’端非翻譯區(qū)微小RNA結(jié)合位點單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤患者預(yù)后的關(guān)系

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科，石家莊 050000）

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是全世界第五大最常見癌癥相關(guān)死亡病因［1］，造成全球約20萬的年死亡病例［2］。美國癌癥登記處指出，NHL的發(fā)病率在過去的幾十年中呈倍數(shù)增長趨勢［3］。NHL是以B或T和NK淋巴細(xì)胞單克隆增殖為特點的一組異質(zhì)性免疫系統(tǒng)腫瘤［4-5］。以往研究［6-8］表明，不同亞型的NHL生存模式不同，而且有不同的預(yù)后危險因素。國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）模型1993年被應(yīng)用于侵襲性NHL患者的預(yù)后預(yù)測，在IPI模型中臨床特征對于預(yù)后至關(guān)重要［9］。但I(xiàn)PI評分一樣的患者也可能顯示不同的生存和預(yù)后。研究［10］發(fā)現(xiàn)遺傳因素可以預(yù)測NHL的生存和預(yù)后。微小RNA（microRNA，miRNA）參與多種生物活動包括發(fā)育、分化、凋亡、生存、衰老、翻譯抑制，并促進(jìn)信使RNA的降解和代謝［11-12］。miRNA在腫瘤中擴增或過表達(dá)，通過結(jié)合靶基因3’端非翻譯區(qū)（3’ untranslated regions，3’-UTRs）的互補序列沉默靶基因從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展［13］。在3’-UTRs靶位點的基因多態(tài)性改變miRNA和靶基因之間親和力，從而影響靶基因的表達(dá)并修改致癌作用［14］。然而，迄今為止miRNA相關(guān)單核苷酸多態(tài)性（miRNA related single nucleotide polymorphism，miRSNPs）和NHL的研究報告很少。本研究中選擇f101 rs4901706來評估其對NHL癌癥風(fēng)險和預(yù)后的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2006年1月1日至2015年10月1日于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科治療的258例患者作為病例組。所有患者均來自中國北方地區(qū)。其中，男152例，女106例，年齡14～87歲，中位年齡為50歲。將患者按照造血與淋巴組織腫瘤WHO分類：（1）惰性淋巴瘤（50例），包括黏膜相關(guān)淋巴組織類型淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤，小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病和T大顆粒淋巴細(xì)胞白血病；（2）侵襲性淋巴瘤（165例），包括彌漫型大B細(xì)胞淋巴瘤，套細(xì)胞淋巴瘤，外周T細(xì)胞淋巴瘤，間變性大細(xì)胞淋巴瘤，血管免疫母T細(xì)胞淋巴瘤；（3）高度侵略性淋巴瘤（32例），包括T和B 淋巴母細(xì)胞白血病，鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤。其余11例患者為不明亞型。選取2011年1月1日至2016年1月1日于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院健康體檢者110例作為對照。本研究獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2016MEC066），所有參與者均知情同意。

1.2 DNA提取和f101基因分型

基因組DNA應(yīng)用向?qū)Щ蚪MDNA提取工具提取。miRNA結(jié)合位點f101（rs4901706）的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）應(yīng)用連接酶檢測反應(yīng)方法進(jìn)行基因分型。引物序列為F：5’-AA ACTAAGTCATCTCCCAGATA-3’；R：5’-GTCATCTG GTGAAAGACTGGA-3’。擴增DNA片段根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用PCR混合試劑盒按照制造商的說明進(jìn)行（Promega）。DNA產(chǎn)品應(yīng)用ABI 3730XL基因分析儀分離。連接用探針為S1（5’-TTTTTTTTTTAATGGGG TATTCAGTGACTAAGA-3’），S2（5’-TTTTTTTTTTTT TAATGGGGTATTCAGTGACTAAGG-3’），S3（5’-TCT GCTATTTATGCAAAATTCTGTTTTTTTT-3’）。多態(tài)性被證實基于rs4901706不同等位基因的長度差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用logrank檢驗及Kaplan-Meier法計算3年總生存率。多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果

258例患者的隨訪時間為10～36個月，隨訪率為100%。期間169例患者死亡，死亡原因分別為疾病進(jìn)展（121例）、感染（25例）、出血（9例）和其他（14例）。3年生存率為34.5%（89/258）。

2.2 臨床病理特征與NHL患者生存率之間的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，B細(xì)胞型患者高于T細(xì)胞型患者（P=0.005）；骨髓非浸潤患者高于骨髓浸潤患者（P=0.001）；無B癥狀患者高于有B癥狀患者（P=0.001）；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平正常患者高于LDH水平偏高患者（P＜0.001）；腫瘤惰性患者高于侵襲性和高度侵襲性患者（P均＜0.05），腫瘤侵襲性患者高于高度侵襲性患者（P=0.023）；Ann Arbor分期為Ⅰ、Ⅱ期的患者高于分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者（P＜0.001）；原發(fā)部位為結(jié)外和淋巴結(jié)的患者高于原發(fā)病為白血病的患者（P＜0.001）；IPI評分為低危的患者高于低中危、中高危和高危的患者（P均＜0.05）；T細(xì)胞亞型為AA型的患者高于AG/GG型患者（P=0.025），見表1。

2.3 f101基因型的分布及其與NHL患者生存率之間的關(guān)系

f101基因型與NHL患者臨床特征（Ann Arbor分期、LDH水平、IPI評分、腫瘤侵襲性）的相關(guān)性通過χ2檢驗進(jìn)行評估，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，見表2。f101基因型為AA型的患者27例（10.5%），AG/GG基因型的患者為231例（89.5%）。f101基因型為AA型患者的3年生存率高于基因型為AG/GG型的患者（P=0.017），見圖1。

2.4 NHL患者f101基因型及臨床病理特征與患者生存率之間的關(guān)系

將上述單因素納入多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示，f101AG/GG基因型可作為NHL患者的獨立預(yù)后指標(biāo)，與患者的生存率（RR：1.768，95%CI：1.045～2.997，P=0.035）密切相關(guān)；同時患者的年齡、侵襲性、原發(fā)部位和IPI評分也與患者生存率密切相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表1 單因素分析NHL患者的臨床特點與生存率相關(guān)性Tab.1 Univariate analysis of the correlation between clinical features and survival rate in NHL patients

3 討論

本研究對258例NHL患者選擇f101基因rs4901706位點的miR-SNP進(jìn)行分析，評估其與NHL癌癥風(fēng)險和預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs4901706基因多態(tài)性與NHL癌癥風(fēng)險無關(guān)。f101rs4901706AA基因型患者的生存時間比AG/GG基因型更長。多因素分析表明，f101rs4901706AA基因型是NHL生存的一個獨立預(yù)后變量。結(jié)果同樣適用于TCL亞組。

miRNA途徑已成為調(diào)控腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵系統(tǒng)。miRNA途徑相關(guān)的SNP，被稱為miR-SNPs，依據(jù)其位置以不同的方式調(diào)節(jié)miRNA的功能，可以直接影響miRNA的表達(dá)水平或影響miRNA與目標(biāo)的相互作用［15］。研究miR-SNPs可以打開新的癌癥生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域，尤其是在危險分層、對治療的反應(yīng)等［16］。BRADSHAW等［17］首次報道MIR143中的miRSNP與高加索人的NHL風(fēng)險降低相關(guān)。PECKHAM-GREGORY等［18］研究表明，一些miRNASNP與AIDS-NHL風(fēng)險有關(guān)，并可能調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)。FU等［19］發(fā)現(xiàn)miR-618參與濾泡性淋巴瘤的發(fā)生，確定miR-618是濾泡性淋巴瘤的潛在危險生物標(biāo)志物，并闡明了miR-618調(diào)控的淋巴瘤發(fā)生途徑。本研究評估rs4901706SNP對NHL癌癥風(fēng)險的預(yù)測能力，結(jié)果顯示兩者沒有關(guān)聯(lián)。YU等［20］使用許多類型的

癌癥作為一個整體研究對象，確定rs4901706SNP與癌癥風(fēng)險有關(guān)，說明miRSNP癌癥風(fēng)險相關(guān)性趨勢可能存在于某些特定的癌癥患者。研究發(fā)現(xiàn)rs4901706的等位基因A與某些特定癌癥風(fēng)險相關(guān)，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該等位基因A提示NHL患者預(yù)后良好，說明參與NHL病因的miRNA-SNP未必影響患者預(yù)后，而影響預(yù)后的miRNA-SNP 未必參與其中。

表2 χ2檢驗單因素分析臨床特征與f101相關(guān)性Tab.2 Correlation between clinical features and f101 using χ2 test

表3 多因素分析f101基因型和臨床特點與NHL生存相關(guān)性Tab.3 Multivariate analysis of the relationship between the f101 genotype and cumulative survival of NHL patients

圖1 rs4901706基因型與TCL生存相關(guān)性Fig.1 Correlation between the rs4901706 genotype and survival of TCL patients

本研究結(jié)果顯示，miRNA結(jié)合位點SNP影響癌癥總生存。f101的3’端非翻譯區(qū)rs4901706SNP改變了其與miRNA的親和力，從而影響它的表達(dá)；rs4901706A→G過渡可能破壞miRNA結(jié)合位點的A：T鍵，調(diào)整f101表達(dá)。然而，本研究的結(jié)果還需要進(jìn)一步驗證。

總之，miRNA結(jié)合位點f101的SNP被發(fā)現(xiàn)是NHL總體生存的一個獨立預(yù)后標(biāo)志。miRNA結(jié)合位點的基因多態(tài)性分析可能有助于識別患者預(yù)后較差的亞組，從而為NHL患者制定治療方案提供依據(jù)。