徠卡免疫組化平臺在非小細胞肺癌間變性淋巴瘤激酶檢測中的價值

丘佳明，顧玉蘭，蔣廷旺，魏 煒，林小星，陳志軍

(常熟市第二人民醫院 1.病理科；2.腫瘤科；3.科技處；4.呼吸內科，江蘇 常熟215500)

肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率均位列所有惡性腫瘤的第一位[1]。肺癌總數的80%-85%是非小細胞肺癌(NSCLC)，間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性NSCLC是肺癌的一種重要分子亞型，占全部NSCLC的3%-7%[2]。近幾年針對于ALK陽性NSCLC的診療研究取得了較大突破，克唑替尼(Crizotinib)、阿來替尼(Alectinib)、塞瑞替尼(Ceritinib)等ALK酪氨酸激酶抑制劑研發成功，可明顯提高ALK陽性NSCLC患者的客觀緩解率，延長生存期。因此，精準檢測ALK基因狀態，對篩選ALK酪氨酸激酶抑制劑的適用患者有決定性的臨床意義。

目前，國家藥品監督管理局(CFDA)已經批準4個檢測方法可以應用于ALK檢測，包括檢測ALK融合蛋白的免疫組織化學(IHC)；檢測DNA水平上ALK基因易位的熒光原位雜交(FISH)；檢測ALK融合mRNA的即時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)；檢測ALK易位DNA序列或融合mRNA序列的二代測序(NGS)。其中FISH被認為是ALK陽性NSCLC診斷的金標準[3]，RT-PCR和NGS也均具有較高的靈敏性、特異性和符合率，但是這3項檢測對樣本、技術水平和實驗室要求較高，收費昂貴且試劑成本高，大部分中小型病理實驗室尚未開展。IHC操作簡單、收費較低，結果判讀相對簡單，適合中小型病理實驗室開展。IHC方法檢測ALK與檢測其它抗體不同，不同的平臺和不同的抗體克隆會有不同的檢測效果。專家共識[4]強烈推薦由Roche Bench Mark XT/Ultra自動免疫組化染色機和Roche Ventana生產的克隆號D5F3的ALK抗體所搭建的平臺(簡稱Roche-IHC平臺)。對于其余的IHC平臺，專家共識意見是僅進行初篩。本實驗選用我院2019年購入并且國內外較多實驗室使用的Leica BOND MAX IHC自動免疫組化染色機和Leica Novocastra生產的克隆號5A4的ALK抗體組成Leica-IHC平臺，進行NSCLC的ALK檢測，并與FISH方法檢測結果進行比較，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集常熟市第二人民醫院2018年1月至2019年12月肺癌手術切除、穿刺活檢和纖支鏡活檢標本，根據2015版WHO肺腫瘤分類[5]，經兩位高年資病理醫師復閱切片，確診為原發且腫瘤細胞數多于100個的NSCLC共197例，包括浸潤性腺癌140例和鱗癌57例。所有標本在離體后即浸于3.7%中性緩沖甲醛溶液，溶液體積10倍于標本體積，固定時間為6-12 h，規范取材，常規脫水，石蠟包埋，4 μm切片。

1.2 IHC檢測及判讀標準檢測儀器為Leica BOND MAX自動免疫組化染色機。一抗試劑為Leica Novocastra ALK單克隆抗體(克隆號5A4)。二抗試劑使用儀器封閉配套試劑，為Leica Bond Polymer Refine Detection Kit試劑套裝。操作流程按照抗體試劑盒說明書進行。每批檢測設置陽性對照和陰性對照。結果判讀參照《常規免疫組織化學初篩ALK陽性非小細胞肺癌專家共識》[6]和抗體說明書,具體如下：0(陰性)：所有腫瘤細胞均無明顯著色；1+：>5%的腫瘤細胞呈現模糊、微弱的細胞質著色，或≤5%的腫瘤細胞呈現任何程度的細胞質著色；2+：>5%的腫瘤細胞呈現中等程度的細胞質著色；3+：>5%的腫瘤細胞呈現較強程度的細胞質著色。

1.3 FISH檢測及判讀標準使用CFDA批準的雅培ALK基因重組檢測試劑盒(Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit)，原位雜交儀為Leica Thermo Brite，熒光顯微鏡為Leica DM2000。操作流程按照試劑盒說明書進行。檢測結果的判定標準為[7]：ALK融合基因無表達的腫瘤細胞將會出現橘紅色和綠色信號重疊融合為黃色，或者相互粘合，即間隔小于兩個信號的直徑；ALK融合基因表達的腫瘤細胞會出現橘紅色和綠色信號相互分離，即兩個信號之間的間距≥2個信號直徑；如果腫瘤細胞出現一個融合的黃色信號和一個單獨的橘紅色信號，也屬于ALK融合基因表達。以此標準，選取100個腫瘤細胞，其中至少有15%出現表達，可判讀為陽性，反之則為陰性。

2 結果

Leica-IHC共有25例陽性，陽性率為12.7%(25/197)(圖1)；FISH共有20例陽性，陽性率為10.2%(20/197)(圖2)。Leica-IHC檢測的25例陽性病例中，1+為5例(FISH陽性1例)，2+為3例(FISH陽性2例)，3+為17例(FISH陽性17例)。Leica-IHC檢測為陰性的病例用FISH方法檢測也均為陰性。Leica-IHC的敏感度為100%，特異度為97.2%，陽性預測值為80%，陰性預測值為100%。對于Leica-IHC檢測為3+病例，敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均為100%。

圖2a FISH檢測ALK在NSCLC的表達(陽性) 圖2b FISH檢測ALK在NSCLC的表達(陰性)

3 討論

精準醫學時代的到來，對檢測精準性的要求越來越高，靶向治療成功的前提是通過可靠的檢測方法篩選出目標人群。對于NSCLC患者來說，準確地檢測ALK是靶向治療的前提。

NSCLC中ALK基因變異主要是ALK基因斷裂后與其它基因進行了重排融合，其中棘皮動物微管相關類蛋白4(EML4)基因與ALK形成的融合亞型最為常見。ALK的酪氨酸激酶區域的外顯子和EML4的N末端卷曲螺旋區域的外顯子相互結合，形成穩定的二聚體，然后通過自身磷酸化，激活下游PI3K/AKT、RAS/MAPK、JAK/STAT3等通路，引起細胞異常分化增殖，促進NSCLC的發生和發展[2]。目前已經發現了20多種EML4-ALK融合亞型，其中最常見的亞型有兩個，一個是E13;A20亞型(EML4外顯子13與ALK外顯子20融合)，另一個是E6a/b;A20亞型(EML4外顯子6a/b與ALK的外顯子20融合)，這兩種約占全部亞型的60%[8]。根據以上的生物學基礎，ALK酪氨酸激酶抑制劑的研發和臨床應用在近年來取得了較多成果，明顯提高了EML4-ALK融合基因陽性NSCLC患者的客觀緩解率，并且延長了無進展生存時間。本實驗所檢測的ALK，即指FISH方法檢測的EML4-ALK融合基因和IHC方法檢測的ALK融合蛋白。除了最常見的ALK與EML4融合外，還已經發現了ALK與其它多個基因的融合變異，包括TFG、KLC1、SOCS5、KIF5B、TPR、H1P1、BIRC6等，這些少見復雜的融合變異類型的臨床意義還需進一步研究[9]。

自1988年第一臺免疫組化儀問世，國內外已經推出了幾十種儀器應用于臨床，主要有羅氏(Roche)、徠卡(Leica)和丹科(Dako)這3個品牌[10,11]，共占據約65%以上的市場份額。本文實驗使用的Leica Bond Max，相比其它兩個品牌，優勢是Covertiles專利技術，獨特的“濕盒”微環境，側面滴加試劑，試劑消耗量最小，還可以最大限度減少組織損傷，同時掉片率也最低，缺點是有標本污染可能。相比FISH檢測，IHC已經有了更規范的標準化流程，更好的技術穩定性，更短的檢測時間，更便宜的試劑，而且對于標本沒有細胞數的限制，本實驗全部197例標本均獲得了實驗數據。本文實驗嚴格按照試劑盒和儀器操作流程,切片整體著色較為鮮艷、核質對比明顯、組織和細胞結構清晰、背景干凈無雜質，檢測ALK的效果滿意，可以滿足日常臨床需要。

IHC平臺檢測效果如何，除了儀器的質量之外，試劑的質量至關重要。目前國內外生產的ALK抗體主要有D5F3、5A4、ALK1、1A4、SP8這五種克隆[12,13]，其中1A4的特異性偏低(70%)，ALK1的敏感性偏低(67%)，SP8更適用于檢測間變性大細胞淋巴瘤，均不推薦常規使用于NSCLC。關于5A4和D5F3這兩個抗體的應用，Savic等[14]通過對303例NSCLC檢測，認為5A4和D5F3同樣適用于NSCLC的ALK檢測，Roche Bench Mark和Leica BOND MAX都可用5A4進行檢測。Marchetti等[15]比較了意大利1031例肺腺癌的兩個IHC平臺檢測方法，并以FISH為參照，Roche-IHC檢測靈敏度、特異性、陽性和陰性預測值與Leica-IHC檢測均近似。Fiset等[16]回顧加拿大5958例肺癌的ALK檢測結果及使用ALK酪氨酸激酶抑制劑的生存期，認為5A4可作為ALK重排肺癌的一種強有力的診斷方法，并與治療反應和生存率相關。Savic等[17]在另外一項關于細胞免疫的研究中，使用Leica-IHC與FISH比較，敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為93.3%、96.0%、93.3%和96%,5A4克隆免疫細胞化學的具有高準確性。本文實驗結果與以上國外報道近似，使用本院新引進的Leica-IHC平臺，以FISH檢測結果為參照，Leica-IHC的敏感度為100%，特異度為97.3%，陽性預測值為80%，陰性預測值為100%。對于Leica-IHC檢測為3+病例，敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均為100%。本文實驗結果可以提示：Leica-IHC檢測為3+病例可判讀為陽性，對于2+和1+病例需FISH方法進行驗證。

綜上所述，Leica-IHC檢測ALK方法可行，應用Leica-IHC平臺進行NSCLC患者ALK初篩是有價值的。