肺孢子菌肺炎診斷方法研究進展

陳杰，彭麗

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶)

0 引言

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)是由耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii，Pj)引起的感染[1]。PCP是艾滋病患者最常見而嚴重的機會性感染。隨著抗病毒治療和預防治療的推廣，艾滋病患者和PCP的發病率在歐美出現下降[2,3]。隨著器官移植和免疫抑制藥物使用的增多，PCP在非人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染者中也變得常見。HIV感染的PCP患者通常會發展為亞急性病程，非HIV感染的免疫功能低下患者的特征是疾病進展迅速，呼吸衰竭的風險更高，死亡率更高[4]。HIV陰性的PCP患者的臨床表現缺乏特異性，早期影像學表現不典型，往往容易被忽視。隨著對PCP認識的加深和檢測技術的發展，目前分子生物學技術已逐漸應用于PCP診斷，但在我國暫未廣泛用于診斷。相對于染色鏡檢，分子生物學檢測方法具有更高的敏感度和特異度，但操作相對復雜。肺孢子菌體外培養困難，目前無常規培養基進行Pj體外培養成功的報道，僅有一個研究發現在氣體與液體培養基交界面借助CuFi-8呼吸道上皮細胞可進行Pj培養[5]，但此培養條件要求高，難以在臨床開展。本文將對目前國內外PCP的診斷方法進行綜述，為臨床恰當使用、評價相關診斷技術與模式提供參考。

1 臨床診斷

HIV患者中PCP癥狀的典型三聯征包括：亞急性發作的勞累性呼吸困難、干咳以及發熱。部分患者還伴有胸悶、消瘦、納差等表現。其亞急性病程通常可與細菌性肺炎及其他疾病區分開。與HIV-PCP相比較，非HIV感染者PCP的潛伏期更短，且病程進展速度較快[4]。肺部聽診以干性啰音為主，部分患者無啰音[6,7]。實驗室檢查以低氧血癥為主，可伴有不同程度貧血。影像檢查對于PCP的臨床診斷極為重要。PCP患者在病程早期胸部X線片并無顯著變化。HIV-PCP患者胸部計算機斷層掃描(Computed Tomography，CT)特征包括磨玻璃影、月牙征、肺氣囊征以及混合型，其中以磨玻璃影最為常見。磨玻璃影可表現為彌漫分布型和斑片狀融合型，HIV感染者以彌漫分布型多見，非HIV感染者以斑片狀融合型多見[8]。因此，在臨床上發現患者有呼吸困難、發熱及干咳等癥狀，且胸部CT提示彌漫性病變存在時，首先需排除HIV-PCP可能。PCP的臨床診斷應綜合患者免疫缺陷狀態、臨床表現以及典型的影像學表現來進行分析。

2 病原診斷

2.1 染色鏡檢

肺孢子菌有包囊和滋養體兩種形態。包囊是重要的診斷形態，包囊呈圓形，內含有囊內小體(或稱子孢子)。呼吸道標本(痰、支氣管肺泡灌洗液或肺組織)檢出肺孢子菌是PCP診斷的金標準。呼吸道標本通過染色鏡檢發現特征性的包囊或滋養體為診斷依據，其中支氣管肺泡灌洗液染色鏡檢陽性率最高[9]。常用的染色方法有六胺銀染色(Gomori’s methenamine sliver staining，GMS)、吉姆薩染色和Diff-Quik染色。吉姆薩染色法可使肺孢子菌包囊內容物呈現紫紅色，但包囊壁無法染色，再通過六胺銀染色可使Pj包囊壁呈現棕褐色，兩種方法聯合可觀察到特征性的包囊結構以確診[10]。有研究發現GMS的敏感性和特異性均為100%，目前使用最廣泛的染色方法是GMS[11]，但GMS使用的染色劑保存時間短，使用時需要臨時配置。國外目前以Diff-Quik染色應用較多，是在Wright染色基礎上改良而來的一種快速染色法，一般在90秒即可完成染色，效果與其他染色相似。用熒光標記的單克隆抗體對呼吸道標本熒光染色后檢出率可達75%-95%，國外已經廣泛用于臨床診斷，但需要精密昂貴的熒光顯微鏡。染色鏡檢雖然操作簡便，但檢出率較低，且與檢驗者經驗和主觀判斷密切相關。

2.2 分子生物學檢測

近年來聚合酶鏈反應(Polymerasechainreaction，PCR)技術逐漸應用于PCP的診斷。應用PCR技術檢測呼吸道標本(痰、支氣管肺泡灌洗液、有創操作獲得的肺組織等)的Pj特異性核酸片段對于PCP診斷有重要意義。Pj PCR靶基因主要有：內轉錄間隔區、線粒體大亞基rRNA(MitochondriallargesubunitrRAN，mtLSUrRNA)、二氫葉酸還原酶、二氫葉酸合成酶、主要表面糖蛋白和熱休克蛋白70等基因[12-19]。目前一般使用多拷貝的mtLSUrRNA作為靶基因。

目前PCR技術檢測肺孢子菌的方法一般分為常規PCR、巢式PCR以及熒光定量PCR。常規PCR檢測是臨床上廣泛使用的方法。Fan等[20]發現PCR診斷的敏感性和特異性分別為98.3%和91.0%。Gupta等[21]用巢氏PCR對基因靶位ITS和mtLSUrRNA進行擴增檢測，發現以mtLSUrRNA作為靶位基因的巢氏PCR敏感性及特異性分別可達100%和98.7%，高于以MSG作為靶位的常規PCR。巢氏PCR擴增檢測mtLSUrRNA或許可用于早期診斷肺孢子菌感染。近年來有研究者將實時熒光定量PCR與巢氏PCR和常規PCR比較，發現實時熒光定量PCR的敏感性和特異性更高[22-24]。

隨著基因測序技術的不斷發展，二代基因測序(Next-generation sequencing，NGS)技術應運而生。PCR依賴已知核酸序列，特異性識別靶向基因位點，而NGS不依賴已知核酸序列和培養技術，可以直接檢測各種臨床樣本(血液、支氣管肺泡灌洗液、腦脊液等)中未知致病微生物的基因序列[25,26]。目前已被應用于病毒、罕見細菌和真菌的快速鑒定。近年來，該方法已應用于肺孢子菌檢測[27]。有研究表明NGS較傳統方法及PCR診斷PCP的敏感性更高[27,28,29]。該方法不僅可以用來明確肺孢子菌感染，但也用于多位點序列分類Pj確定菌株利于PCP的流行病學調查[30]。但NGS檢測的價格昂貴、數據存儲空間大，目前只在少數臨床中心開展，大多數在第三方機構進行此項檢測。

3 血清學檢測

3.1 (1,3)-β-D-葡聚糖 ((1,3)-β-D-glucan, BG)

BG是一種多聚糖成分，存在多種真菌的細胞壁中，也存在于Pj細胞壁中，可作為PCP輔助診斷的一種血清標志物。Salerno等[31]發現BG升高與HIV-PCP相關性好，若以300pg/mL為陽性閾值，其敏感性為91%，特異性為92%。一項薈萃分析表明BG診斷PCP的敏感性為92%～98%，特異性為83%～86%，可考慮作為臨床診斷PCP的篩選指標[32]。Damiani等[33]研究發現呼吸道標本PCR檢測結果結合恰當的BG閾值能區別Pj定植和PCP。由于其他真菌感染也可引起BG升高，當其呈陽性時，仍需結合其他方法如染色鏡檢法、PCR或NGS進一步確診。

3.2 乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)

有研究發現血清LDH在PCP患者中有不同程度的升高[34,35]。多項研究認為血清LDH升高有助于輔助診斷PCP[32,36,37]。Vogel等[38]在HIV感染和非HIV感染人群中進行血清LDH敏感性和特異性的分析，結果表明在HIV-PCP患者中LDH的敏感性和特異性分別為100%、47%，非HIV-PCP感染患者中敏感性和特異性分別為63%、43%，提示在HIV感染人群中，陽性結果支持PCP診斷，在非HIV感染患者中LDH價值不大。同時，LDH升高在其他肺部感染、腫瘤等疾病也可見[39]。血清LDH升高僅能作為PCP的一項輔助診斷手段。

綜上所述，PCP已逐漸成為免疫機能低下人群的常見機會性感染，給這一群體的生存質量和生命帶來極大的威脅。在傳統的臨床診斷方法上，建立加入PCR和NGS為主的分子生物學診斷方法，將減少漏診及誤診，將對本病的早期診斷和治療以及預后產生積極的作用。