糖皮質激素受體對大鼠丙泊酚依賴行為的影響及其機制

董張雷，梁宇淵，蘇穎，林函，王本福

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 麻醉與圍術期醫學科，浙江 溫州 325027）

丙泊酚是一種短效靜脈麻醉藥，因使用方便，誘導平穩，蘇醒迅速等優點，被廣泛用于麻醉及ICU鎮靜。臨床資料和動物實驗均表明丙泊酚存在潛在的精神依賴和濫用傾向[1-4]。伏隔核（nucleus accumbens，NAc）多巴胺系統是中腦邊緣系統重要組成部分，參與眾多藥物成癮過程。前期研究表明，NAc多巴胺D1受體參與丙泊酚自身給藥行為[4]。糖皮質激素（glucocorticoid，GC）由HPA軸分泌，通過調節NAc內多巴胺釋放及多巴胺受體表達來影響藥物成癮[5]。本實驗通過頸內靜脈自身給藥方法建立大鼠丙泊酚依賴模型，腹腔注射糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）拮抗劑RU486，觀察大鼠丙泊酚依賴行為改變，并檢測NAc內多巴胺轉運體（dopamine transporter，DAT）蛋白的表達，探討GR對大鼠丙泊酚覓藥行為的影響，以及丙泊酚精神依賴性的發生機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雄性SD大鼠48只（上海斯萊克實驗動物中心），14周齡，體質量250～280 g。動物分籠飼養于通風良好的動物房內，24 h晝夜節律（9 am—9 pm），每日限制進食30 g，自由進水。環境溫度22～24℃，相對濕度50%～70%。

1.1.2 試劑及配置：RU486（美國Sigma公司）為脂溶性藥物，易穿過血-腦屏障，由10%無水乙醇溶解備用，可通過外周給藥。丙泊酚（意大利阿斯利康公司，批號NK317），Anti-Dopamine Transporter antibody（英國Abcam公司），大鼠自發反應操作籠（寧波生物科技研究所），電子天平（德國賽多利斯公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠靜脈給藥訓練：24只大鼠頸內靜脈置管后進行丙泊酚自身給藥行為訓練，方法同文獻[4]。每天9:00—12:00為訓練時間，每天訓練3 h，連續訓練14 d，直到大鼠自身給藥行為穩定。實驗前確定大鼠頸內靜脈血管通暢、無滲漏，實驗期內禁食。大鼠自身給藥訓練選用FR1強化程序，整個實驗過程由計算機自動控制并記錄。第15天在訓練開始前1 h將大鼠隨機分成4組（每組6只），分別腹腔注射0.9%氯化鈉溶液或RU486 10、20和40 mg/kg，觀察對大鼠自身覓藥行為的影響。

1.2.2 Western blot檢測：第15天大鼠訓練結束后立即將大鼠處死，將分離出的腦組織放入勻漿器中，加入蛋白酶抑制劑和裂解液，充分搗碎后靜置數分鐘。然后將腦組織勻漿液轉移至1.5 mL離心管內，超聲破碎，離心機離心后用EXCEL制作蛋白濃度測定盒描繪標準曲線測定樣品蛋白濃度。在蛋白上清液中加入Loading buffer，煮沸使其變性，于-20℃冰箱保存。10%分離膠和5%濃縮膠制膠，20 μL總蛋白上樣。電泳轉膜后室溫封閉2 h。加一抗，4 ℃搖床過夜，二抗常溫孵育2 h，加抗體前均需TBST洗3次。用ECL試劑盒暗室曝光，顯影、定影，Image J 2.0軟件分析結果。

1.2.3 自身給予蔗糖實驗：取剩余24只大鼠放入訓練籠，在訓練籠上端的容器內放入100顆蔗糖顆粒，開啟FR1自身訓練程序，訓練時間為30 min，連續訓練7 d。訓練過程同丙泊酚自身給藥模型，唯一區別是觸碰有效鼻觸時獲得的是蔗糖顆粒。在第8天訓練開始前1 h將大鼠隨機分為4組（每組6只），分別注射0.9%氯化鈉溶液或RU486 10、20和40 mg/kg，記錄RU486對大鼠自身給予蔗糖行為的影響。計算機自動記錄實驗過程。

1.3 統計學處理方法 用SPSS26.0統計軟件進行分析。所有數據均服從正態分布，以±s表示，其中模型建立數據采用重復測量方差分析，腹腔注射給藥后各組大鼠行為學對比及Western blot檢測結果采用單因素方差分析，Levene法檢驗方差齊性，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹腔注射RU486對大鼠丙泊酚自身覓藥行為的影響 隨著丙泊酚靜脈自身給藥行為訓練天數的增加，大鼠有效鼻觸次數和藥物泵注次數逐漸增加并趨于穩定，而無效鼻觸次數一直處于較低水平。和無效鼻觸次數比，有效鼻觸次數明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），說明大鼠丙泊酚自身給藥行為穩定（見圖1）。第15天訓練前1 h，4組大鼠分別腹腔注射0.9%氯化鈉溶液和10、20、40 mg/kg RU486。與對照組比，各RU486組大鼠有效鼻觸次數和有效泵注次數呈劑量依賴性下降（P＜0.01），無效鼻觸次數則無明顯變化（P＞0.05），見圖2。

圖1 大鼠丙泊酚自身給藥模型建立（n=24）

圖2 腹腔注射RU486對大鼠丙泊酚自身覓藥行為的影響（每組n=6）

2.2 腹腔注射RU486對NAc內DAT蛋白表達的影響 與對照組比，腹腔注射RU486（10、20、40 mg/kg）后，NAc內DAT蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 腹腔注射RU486對丙泊酚依賴大鼠NAc內DAT蛋白表達的影響（每組n=6）

2.3 腹腔注射RU486對大鼠自身給予蔗糖行為的影響 大鼠自身給予蔗糖訓練第5天起，蔗糖顆粒攝入次數保持在100次水平，表明模型穩定。第8天4組大鼠分別腹腔注射0.9%氯化鈉溶液和10、20、40 mg/kg RU486，與對照組比，RU486不同劑量組有效鼻觸次數、無效鼻觸次數及攝入蔗糖顆粒數均無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 腹腔注射RU486對大鼠自身給予蔗糖行為的影響（每組n=6）

3 討論

關于丙泊酚濫用和死亡的報道越來越多，但具體的成癮機制仍未完全闡明[6]。GC是HPA軸激活后腎上腺皮質分泌的激素，對中樞神經系統有較強的作用，參與認知功能、情緒變化的調控及成癮狀態的調節[7]。研究顯示，GC過度分泌可易化個體藥物濫用傾向[8]，GC參與藥物的獎賞作用，如腎上腺切除的動物對精神類藥物的攝入明顯減少，且NAc多巴胺濃度明顯降低[9]，而GR激動劑增加動物對大多數成癮藥物（如嗎啡、可卡因等）的精神依賴性[10]，使用Cre-loxP基因重組方法敲除神經系統GR或使用GR拮抗劑均可減弱動物對可卡因的依賴性[11]。本實驗發現，腹腔注射GR拮抗劑RU486能劑量依賴性地減少大鼠丙泊酚覓藥行為，而不影響蔗糖自身給藥行為，表明GR參與丙泊酚精神依賴性且具有特異性。

GC集中分布于NAc、海馬、杏仁核、皮質層等各個腦區，主要調節多巴胺受體的表達。而藥物的獎賞效應主要與多巴胺系統有關，尤其是中腦腹側被蓋區（VTA）至NAc的多巴胺能神經通路[12]。增加NAc細胞外的多巴胺含量可產生獎賞效應，反之則減弱獎賞效應。DAT屬于Na/Cl依賴轉運體家族的一員，是多巴胺神經元前膜的一種膜蛋白，限制多巴胺能受體激活的持續時間、程度和范圍，終止神經細胞間的信息傳遞，尤其是對突觸間隙間的多巴胺的重攝取，維持神經元內多巴胺濃度的穩態[13-14]，因此，DAT功能失調會導致腦內多巴胺水平失衡，引起精神分裂及藥物依賴等多種精神疾病。目前普遍認為精神興奮性藥物主要通過作用于DAT來調節多巴胺能神經信號通路，提高突觸間隙間多巴胺含量，促進其在中腦邊緣皮質獎賞通路中發揮作用從而誘發獎賞行為或精神依賴[15]。大量研究證實DAT表達水平與可卡因、安非他命等藥物成癮關系密切。安非他命通過囊泡釋放和促進DAT逆向轉運引起細胞外多巴胺濃度升高[16]。DAT敲除的小鼠對可卡因的成癮行為消失，同時DAT阻滯劑JHW007明顯降低可卡因成癮動機和其引起的NAc細胞外多巴胺的增加[17-18]。可卡因急性給藥可引起多巴胺能神經元細胞外多巴胺濃度升高[19]，PAIN等[20]也發現麻醉或亞麻醉劑量的丙泊酚增加NAc細胞外的多巴胺水平。而我們前期研究也發現多巴胺D1受體參與介導丙泊酚成癮行為[4]，因此我們推測DAT蛋白在丙泊酚成癮行為中也可能發揮作用。本研究結果發現，腹腔注射RU486能降低大鼠NAc內的DAT蛋白水平并減少大鼠覓藥行為，提示RU486可能通過減少NAc內DAT的蛋白水平，導致神經元細胞外多巴胺濃度減少，從而降低了大鼠的覓藥動機。

綜上所述，本實驗顯示，GR參與介導丙泊酚的自身給藥行為，GR拮抗劑RU486可能通過降低NAc內DAT水平而減弱大鼠丙泊酚覓藥行為。