一株具有降解玉米赤霉烯酮能力的凝結(jié)芽孢桿菌的分離、鑒定及其發(fā)酵條件的確定

佟德軍 徐建志 徐潔 戎曉平 萬俊康 賈佩嶠

摘 要：從池塘養(yǎng)殖鯉魚中分離出一株具有降解玉米赤霉烯酮能力的芽孢桿菌，經(jīng)16S rDNA比對鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。經(jīng)液相色譜方法檢測其發(fā)酵上清液對玉米赤霉烯酮的24、48 h降解能力分別為62%和84%。經(jīng)發(fā)酵實驗得到此株凝結(jié)芽孢桿菌的最適生長條件為：40 ℃，pH值 6.4，經(jīng)36 h好氧液體發(fā)酵可得25.9億個/mL的活菌數(shù)，最佳液體培養(yǎng)基為：蛋白胨15‰，酵母粉5‰，玉米粉15‰，葡萄糖20‰，麩皮10‰。綜合實驗結(jié)果，此株凝結(jié)芽孢桿菌可作為飼料添加劑用于飼料中霉菌毒素的降解和提高動物抗病能力。

關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮;凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）;飼料安全;霉菌毒素

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)包括水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對飼料的需求量逐年增加，與飼料中霉菌毒素相關(guān)的食品安全也越來越受到重視[1-2]。乳酸作為小分子有機酸在進(jìn)入動物腸道后可以有效提高動物對病原菌的抵抗能力[3]。對飼料中霉菌毒素的處理方式從蒙脫石等無機礦物質(zhì)的吸附到酵母細(xì)胞壁等生物源物質(zhì)的吸附，再到在飼料里添加可以降解霉菌毒素的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物[4]，對霉菌毒素的降解效率越來越高。目前生產(chǎn)中使用的具有降解霉菌毒素能力的微生物多數(shù)為枯草芽孢桿菌，篩選同時具有降解霉菌毒素和產(chǎn)乳酸的菌株對提高動物抗病能力和減輕飼料中霉菌毒素的危害具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及檢測服務(wù)商

枯草芽孢桿菌（購自市場，用于陽性對照）。對玉米赤霉烯酮的降解能力按照國標(biāo)GB/T 28716-2012檢測[5]。菌株16S rDNA序列測定由上海邁浦生物科技有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選與鑒定 原始樣品采集于河北省樂亭縣某養(yǎng)殖池塘。將捕撈上來的鯉魚用無菌剪刀取出內(nèi)臟，置于滅菌紗布上，并放置于碎冰上。以無菌操作取腸道內(nèi)容物，以無菌生理鹽水10倍稀釋后，傾注法在添加5‰ CaCO3的MRS平板37 ℃培養(yǎng)，逐日觀察菌落情況和形成的水解圈情況。

對具有產(chǎn)酸能力的菌株，挑取單菌落接種入MRS液體培養(yǎng)基三角瓶培養(yǎng)。在指數(shù)期停止培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心，取上清液測定其玉米赤霉烯酮毒素在24、48 h的降解率。

對同時具有產(chǎn)酸和降解毒素能力的菌株，經(jīng)純化培養(yǎng)后進(jìn)行16S rDNA序列測定，將測序結(jié)果同NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定菌株分類地位。

1.2.2 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定 對鑒定出的菌株采用正交試驗法設(shè)計實驗方案（表1），每配方3個重復(fù)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗。

2 結(jié)果與分析

共篩選得到8株可以在添加CaCO3的MRS平板上形成水解圈的菌株、1株對玉米赤霉烯酮具有降解能力的菌株。將同時具有降解玉米赤霉烯酮能力和產(chǎn)酸能力的此株細(xì)菌編號為320。

菌株320在MRS平板上的菌落特征為：表面褶皺，暗黃色，直徑1～3 mm，不產(chǎn)色素，在含有碳酸鈣的平板上能產(chǎn)生明顯的水解圈。

16S rDNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫通過BLAST比較，與凝結(jié)芽孢桿菌具有99%相似性，故定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。

經(jīng)正交實驗結(jié)果比較可知，菌株320最適三角瓶液體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨15‰，酵母粉5‰，玉米粉15‰，葡萄糖20‰，麩皮10‰，極差法分析可知培養(yǎng)基中對發(fā)酵菌數(shù)影響力大小為：麩皮>葡萄糖>玉米面>蛋白胨>酵母浸粉。

3 結(jié)論

由鯉魚腸道篩選到的這株凝結(jié)芽孢桿菌320菌株同時具有產(chǎn)酸和降解玉米赤霉烯酮的能力，可用于飼料添加劑。其最適搖瓶發(fā)酵配方為：蛋白胨15‰，酵母粉5‰，玉米粉15‰，葡萄糖20‰，麩皮10‰;最適條件下培養(yǎng)36 h后有效活菌數(shù)可達(dá)到25.9×108 CFU/mL。凝結(jié)芽孢桿菌320菌株可用于飼料添加，以提高動物抗病力和降低飼料中霉菌毒素的危害。

參考文獻(xiàn)：

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楊麗梅，申光榮.飼料中霉菌毒素的危害及其預(yù)防[J].飼料工業(yè)，2003，24（12）：53-55.

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[3] 黃燕華，周曉波，王國霞，等.5種乳酸菌對奧尼羅非魚免疫和抗病力的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（10）：601-605.

[4] 王麗娜，周盛昌.防霉劑和脫霉劑在飼料中的應(yīng)用[J].今日養(yǎng)豬業(yè)，2019（05）：100-101.

[5] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.飼料中玉米赤霉烯酮的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法： GB/T 28716-2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

（收稿日期：2020-10-15;修回日期：2020-11-05）