一株廣西雞源H6亞型禽流感病毒全基因組序列分析及其重要生物學特性

李孟　謝芝勛　李丹　羅思思　謝麗基　張民秀　黃嬌玲　范晴　王盛　謝志勤　鄧顯文　曾婷婷　張艷芳

摘要 2017年對廣西地區活禽交易市場進行低致病性禽流感流行病學調查，從采集的雞咽喉和泄殖腔拭子中分離鑒定出一株雞源H6N6亞型禽流感病毒，命名為A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）。應用RT-PCR方法分別對分離毒株的8個基因片段進行擴增，同時將產物進行克隆和測序，然后對測序結果進行同源性比對及遺傳進化分析。另外，還通過固相受體結合試驗對毒株的唾液酸受體進行測定。結果顯示，該分離株的 HA 基因與廣東分離株A/chicken/Guangdong/G3249/2014（H6）的核苷酸同源性最高，裂解位點符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因與江西分離株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6）核苷酸同源性最高;內部基因中，PB1和NS基因來源于廣東的雞，PB2基因來源于越南的雞，PA、NP和M基因來源于廣西的鵝;同時，研究還發現該病毒的HA、NA、PA、NP和M基因來源H6亞型AIV，PB2、PB1和NS基因來源H9N2亞型AIV，推測A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）可能是由不同地區、不同宿主來源的H6和H9亞型 AIV通過基因重組產生的一株新的重配毒株。由于廣西地理位置特殊，今后應加強對該地區H6亞型禽流感病毒變異情況的監測。

關鍵詞 禽流感病毒;H6亞型;雞;遺傳進化;受體分析

中圖分類號 S 852.65文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）23-0125-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.030

Whole Genome Sequence Analysis and Important Biological Characteristics of a Strain of H6 Subtype Avian Influenza Virus from Chicken in Guangxi

LI Meng，XIE Zhi-xun，LI Dan et al

（Guangxi Veterinary Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Nanning，Guangxi? 530001）

Abstract In 2017，an epidemiological investigation of low-pathogenicity avian influenza was conducted in the live poultry trading market of Guangxi.One strain of H6N6 subtype of avian influenza virus was isolated and identified from throat and cloacal swab samples of chicken，named A/chicken/Guangxi / 286C10/2017（H6N6）.RT-PCR was used to amplify 8 gene fragments of isolated strains，and the products were cloned and sequenced at the same time.Then homology comparison and genetic evolution analysis were performed on the sequencing results.In addition，the sialic acid receptor of the strain was determined by solid phase receptor binding test.The results showed that HA gene in the isolated strain from Guangdong had the highest nucleotide homology with that in A/chicken/Guangdong/G3249/2014 （H6），and the? cracking sites conformed to the molecular characteristics of low pathogenic avian influenza virus.NA genes in the isolated from this strain had the highest nucleotide similarity with that in? isolated strain A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6）.Among internal genes，PB1 and NS genes were derived from chicken in Guangdong， PB2 gene was? derived from chicken in Vietnam，and PA，NP and M genes were derived from geese in Guangxi.At the same time，we found that the HA，NA，PA，NP and M genes in this virus were from H6 subtype of AIV，PB2，PB1 and NS genes were from H9N2 subtype of AIV，and it was speculated that A/chicken/Guangxi / 286C10/2017 （H6N6） might be a new strain of H6 and H9 subtypes of AIV from different regions，different host sources by gene recombination. Due to special geographical location of Guangxi，the monitoring of the variation of H6 subtype avian influenza virus in this region should be strengthened in the future.

Key words Avian influenza virus;H6 subtype;Chicken;Genetic evolution;Receptor analysis

禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種動物傳染性疾病。禽流感病毒基因組由8個不同的獨立片段組成，其片段包括 HA、NA、PB2、 PB1、 PA、 NP、 M和NS基因[1]。同時，依據AIV對雞的致病性，將AIV分為高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）[2]。1965年美國科學家從水禽樣品中首次分離到H6亞型AIV[3]，目前研究已發現H6亞型AIV廣泛存在于各種宿主動物并在世界各地傳播[4-5];我國一些學者的研究表明，近年來我國華東和華南地區家禽中H6亞型AIV屬于分離率較高的禽流感亞型之一[6-8]。同時，一些其他研究也發現某些H6亞型AIV可以跨越動物種屬屏障，直接感染哺乳動物小鼠和水貂等，甚至在采集的健康人群血清中檢測到抗H6亞型AIV的特異性抗體[9-11]。2013年5月，我國臺灣地區首次報道了H6N1亞型AIV直接感染人的病例[12]，通過基因遺傳進化分析還發現H6亞型AIV可以為感染人的H5N6、H7N9和H9N2等亞型禽流感病毒提供內部基因[13-15]。以上研究結果表明，H6亞型AIV存在潛在的直接感染哺乳動物和人的可能性，且嚴重威脅到人類的公共衛生安全。

筆者所在實驗室自2009年以來一直對廣西地區活禽交易市場進行AIV流行病學監測，已經從表觀健康的家禽體內分離到多株不同HA和NA組合的H6亞型AIV[16]。由于H6亞型AIV經常與H5、H9等亞型AIV同時存在于家禽體內，當不同亞型AIV同時感染一只家禽時，就大大增加了流感病毒基因重排的概率，為產生新的禽流感病毒株創造了便利條件。廣西處于華南“流感中心”，且與禽流感疫情十分復雜的越南山水相連，同時還處在候鳥遷徙路線上，地理位置十分特殊。筆者于2017年從廣西活禽市場分離到1株具有代表性的雞源H6N6病毒，進行全基因組測序并分析其遺傳演化情況，同時對部分重要生物學特性進行了測定，以期了解H6亞型AIV在廣西地區的遺傳進化及變異情況，為該亞型禽流感病毒的研究和防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與雞胚。

2017年從廣西地區某活禽交易市場采集表觀健康雞群的咽喉和泄殖腔棉拭子，置于含有4種抗生素的保存液中，低溫運輸至廣西獸醫生物技術重點實驗室進行病毒分離和鑒定。9～11日胚齡SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑。DNA/RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、感受態細胞、PCR產物快速連接載體和DNA Marker均購自北京全式金生物技術有限公司;高保真2× PCR Mix、隨機引物、dNTP、MLV 反轉錄酶和RNA酶抑制劑均購自寶生物工程（北京）有限公司;6′-Sialyllactose-PAA-biotin（6′SL-PAA）和3′-Sialyllactose-PAA-biotin（3′SL-PAA）購自GlycoTech公司;TMD底物溶液購自北京天根生物科技有限公司;Streptavidin-HRP購自美國R&D systems公司;其余試劑購自商業公司，均為國產分析純。

1.1.3 引物設計及合成。參照文獻[17]及GenBank中收錄的相關H6亞型AIV的全基因序列，利用 Primer Premier 和Oligo軟件設計多對A型流感病毒基因組8個節段的引物，用于擴增A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）全基因，引物由南寧捷瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離、鑒定及空斑純化。將不同活禽交易市場現場采集的雞群棉拭子樣品低溫快速轉運至實驗室處理，經離心取上清液接種于10日胚齡SPF雞胚尿囊腔，每個樣品接種2枚雞胚，0.2 mL/枚，37? ℃孵化96 h;收獲24 h后死亡和未死亡的雞胚尿囊液，分別采用血凝試驗（HA）和血凝抑制（HI）試驗進行鑒定，用針對H1～H16亞型AIV以及新城疫病毒的多抗血清對具有HA效價的樣品進行HI試驗，初步確定樣品的HA亞型。將HI試驗確定為H6亞型AIV病毒株尿囊液接種于雞胚成纖維細胞（CEF），通過空斑純化的方法進行連續3輪的克隆純化，再接種SPF雞胚對純化的毒株進行增殖，將收獲尿囊液經HI試驗鑒定后，-80 ℃下保存備用。

1.2.2 病毒RNA提取與RT-PCR擴增。

取經空斑純化后增殖的病毒尿囊液，使用RNA 抽提試劑盒按照使用說明書提取其病毒總RNA，利用流感病毒Uni-12通用引物及反轉錄酶按照其使用說明書進行cDNA合成。根據不同的基因引物設計不同的PCR程序，分別對各基因片段進行擴增。PCR擴增產物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 PCR產物的回收純化及克隆測序。

將目的片段從瓊脂糖凝膠切下后，按照膠回收試劑盒說明書進行回收純化，然后與快速克隆載體進行連接后轉化至感受態細胞中，涂板培養后挑取單個菌落進行菌液PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的菌液送交深圳華大基因（廣州）公司進行序列測序。

1.2.4 序列比對及遺傳進化分析。利用DNASTAR軟件對毒株各基因測序結果進行比對和整理，并將比對結果與NCBI網站中的相關參考毒株進行分析。同時，選擇一些具有代表性的參考毒株基因序列及不同宿主來源的H6亞型AIV基因序列，應用MEGA6.0軟件對分離株和參考株的各基因進行比對，并構建其遺傳進化樹，進而分析分離毒株的遺傳演化情況。

1.2.5 分離株受體親和特性的測定。根據病毒的HA效價，用包被緩沖液將分離毒株尿囊液稀釋至7log2，將準備好的病毒液100 μL/孔加入96孔ELISA板，放置4 ℃冰箱中包被過夜，設置空白對照;將6′SL-PAA及3′SL-PAA分別設置4個不同的稀釋梯度，每個稀釋梯度設3個重復，病毒和受體反應終止后，用酶標儀讀取樣品在450 nm波長處的吸光值。

2 結果與分析

2.1 病毒的分離鑒定及純化結果 收集HA試驗效價大于或等于4log2的雞胚尿囊液樣品，進行HI試驗。編號為286C10樣品的尿囊液HI試驗結果表明，其僅與H6亞型AIV抗血清發生作用，而與其他HA亞型AIV和新城疫病毒抗血清不存在任何交叉作用，其結果初步確定該分離株為H6亞型AIV。該毒株的尿囊液接種于CEF細胞上，經過3輪的空斑純化后，經過SPF雞胚增殖，通過HA試驗測得其效價為26。同時，通過HI試驗測定其對抗H6亞型AIV陽性血清的HI效價為8log2。

2.2 病毒全基因RT-PCR擴增及克隆測序結果

RT-PCR擴增均得到與引物設計預期大小相符的目的基因條帶。各目的基因經克隆和PCR鑒定成功后測序，測序結果用DNAStar軟件進行比對，將拼接后的基因序列進行同源性BLAST比對分析。比對結果表明，HA和NA基因與H6及N6亞型AIV的核苷酸同源性最高。因此，將該分離毒株命名為A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）。

2.3 分離株各基因片段的序列比對及遺傳進化分析

各個基因經過比對拼接形成病毒的全基因序列，各片段與GenBank中核苷酸同源性最高的病毒株進行BLAST分析，分析結果見表1。A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6） HA基因比對結果與廣東雞源分離株A/chicken/Guangdong/G3249/2014（H6） 相似性最高，核苷酸同源性為98.53%。序列分析結果表明，其HA 基因開放閱讀框（ORF）全長1 701 bp。HA1和HA2蛋白裂解位點不存在3個以上連續的堿性氨基酸，具有低致病性AIV的分子特征。HA受體結合位點第226（參照H3亞型編號）位氨基酸未發生Q226L突變。HA基因遺傳進化樹分析表明，該毒株屬于歐亞進化譜系的ST339-like分支，與北美分支H6病毒株有一定的遺傳距離（圖1）。NA基因的ORF全長為1 413 bp，與A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）的NA基因核苷酸同源性最高的毒株為江西分離株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6），核苷酸同源性為98.80%。PB2基因的ORF全長為2 280 bp，與 A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）的PB2基因核苷酸同源性最高的毒株為越南分離株 A/chicken/Vietnam/H7F-14-BN4-339/2014（H9N2），核苷酸同源性為99.25%。PB1基因的ORF全長為2 274 bp，與 PB1 基因核苷酸同源性最高的毒株是廣東分離株A/chicken/Shenzhen/1377/2013（H9N2），核苷酸同源性為96.26%。PA基因編碼區全長為2 151 bp，同源性最高的毒株為A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性為98.47%。NP基因編碼區全長為1 497 bp，與其核苷酸同源性最高的毒株是 A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性為 98.13%。M 基因編碼區全長982 bp，與M基因核苷酸同源性最高的毒株為A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性為99.12%。NS基因編碼區全長838 bp，核苷酸同源性最高的毒株為 A/chicken/Guangdong/SIC41/2015（H9N2），核苷酸同源性為99.55%。

2.4 受體親和性測定結果 通過酶聯免疫吸附試驗對純化的毒株進行了受體結合特異性的測定，結果表明分離毒株雖然優先選擇與SAα2，3受體結合，但也同時具有與SAα2，6受體的親和特性，但結合能力存在差異（其與α-2，3唾液酸受體結合能力稍強，見圖2），表明該雞源H6N6 AIV 同時具備與α-2，3和α-2，6唾液酸受體結合的特性，具有潛在的感染人的風險。

3 討論

AIV由于亞型眾多，極易發生變異和重組，研究表明部分亞型AIV能夠跨越種屬屏障感染直接感染哺乳動物和人，不但給全球養禽業造成嚴重的經濟損失，而且還會威脅到人類公共衛生安全[18]。高致病性H5和H7亞型AIV及低致病性的H9亞型AIV分別因其對家禽的高致死率及在家禽中的廣泛流行而受到人們的普遍關注[19]。低致病性的H6亞型AIV雖然在自然界中普遍存在，但由于其一般不引起宿主產生明顯的臨床癥狀和死亡，因而一直沒有引起人們對它的重視。2014年5月在我國四川地區首次出現人感染H5N6亞型 AIV 病例，通過對毒株基因組分析發現該病毒的NA基因片段來自禽源H6N6亞型病毒[20]。另外，有報道利用血清學調查的方法在美國和中國的健康人群中發現了一定比例的H6亞型AIV抗體陽性人員[21]。因此，H6亞型AIV引起的公共衛生安全問題已經越來越引起人們的重視。

廣西地處我國華南地區，同時又處于全球8大候鳥遷徙路線之一的東亞和澳大利亞線路上，每年都有大量遷徙的候鳥途經此地。此外，廣西是全國的養禽大省，與廣東等省份有著頻繁的活禽貿易往來，還與流感疫情復雜的越南相鄰，加上廣西地區人口稠密，活禽市場遍布城鄉，水禽養殖規模大，且有放養畜禽的習慣，人與家禽、野鳥和候鳥的生活空間高度重疊，密切接觸，這些都為流感病毒變異株或新亞型AIV的產生創造了理想的條件，嚴重威脅畜牧業和公共衛生的安全。當不同亞型和不同宿主來源的AIV在感染同一宿主或細胞時，病毒可以通過交換某些基因片段發生基因重排，進而產生新的子代重配病毒，研究也表明自然界往往會發生多重AIV重組[22-23]。通過對雞源A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6） 病毒的全部基因組序列進行分析以及與其他亞型病毒株的比較顯示，該研究中的病毒基因組的序列來源可能各不相同：HA、PB1和NS基因來源于廣東的雞，NA基因來源于江西的鴨，PB2基因來源于越南的雞，PA、NP和M基因來源于廣西的鵝;同時研究還發現該病毒的HA、NA、PA、NP和M基因來源H6亞型AIV，PB2、PB1和NS基因基因來源H9N2亞型AIV，推測A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）可能是由不同地區不同宿主來源的H6和H9亞型 AIV通過基因重組產生的一株新的重配毒株，由此可見該病毒基因來源的復雜性。正是因為復雜來源及重配導致目前AIV毒株的生物學特性也變得日益復雜化，同時也給AI 的科學綜合防控造成新的難題。

已有的研究發現禽流感病毒HA蛋白某些受體結合位點的特異性可以決定該病毒感染的宿主范圍[24]，A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）HA基因的226位受體結合位點沒有由Q變異為L，說明該毒株存在與哺乳動物受體結合的潛在可能性較小。該研究中AIV受體結合試驗的結果也顯示A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）具備與α-2，6唾液酸受體結合的特性（即跨越種屬屏障感染哺乳動物），該毒株其他相關的生物學特性有待進一步深入研究和驗證。近年來的流行病學調查結果顯示，家禽中H6N6亞型AIV的分離率逐漸升高，H6N6亞型AIV極易與其他亞型的禽流感病毒在宿主體內發生基因重配進而形成新的流感病毒重組毒株或變異株，對畜牧業健康發展和對人類公共衛生安全構成嚴重的威脅。因此，深入研究H6N6 AIV的起源、進化和生物學特性等的變化對H6亞型禽流感病毒的科學防控具有重要意義。

參考文獻

[1]譚偉，徐倩，謝芝勛.禽流感病毒研究概述[J].基因組學與應用生物學，2014，33（1）：194-199.

[2] 秦愛建.禽流感病毒[M]//韋平，秦愛建.重要動物病毒分子生物學.北京： 科學出版社，2008：3-27.

[3]王熹婧，朱銀川，龐夏鳳，等.H6N6亞型禽流感病毒進化演變及跨種屬傳播研究進展[J].中國人獸共患病學報，2019，35（6）：558-562.

[4] 陳思，崔鵬飛，關立崢，等.一株H6N6亞型野鳥禽流感病毒全基因組序列分析以及對小鼠的感染性研究[J].中國預防獸醫學報，2017，39（6）：431-434.

[5] 陳佳琪，嵇辛勤，段志強，等.一株鴨源H6N6亞型禽流感病毒的遺傳進化及致病性分析[J].中國預防獸醫學報，2016，38（3）：175-179.

[6] HUANG K，ZHU H C，FAN X H，et al.Establishment and lineage replacement of H6 influenza viruses in domestic ducks in southern China[J].J Virol，2016，86（11）：6075-6083.

[7] WU H B，LU R F，PENG X M，et al.Isolation and genetic characterization of novel reassortant H6N6 subtype avian influenza viruses isolated from chickens in eastern China[J].Arch Virol，2016，161：1859-1872.

[8] YUAN R Y，ZOU L R，KANG Y F，et al.Reassortment of avian influenza A/H6N6 viruses from live poultry markets in Guangdong，China[J].Front Microbiol，2016，7：1-8.

[9] KIM H R，LEE Y J，LEE K K，et al.Genetic relatedness of H6 subtype avian influenza viruses isolated from wild birds and domestic ducks in Korea and their pathogenicity in animals[J].J Gen Virol，2010，91：208-219.

[10] 葛志闖，孫文強，劉東，等.一株鴨源H6N6亞型禽流感病毒的基因組測序及遺傳進化分析[J].中國家禽，2017，39（14）：21-28.

[11] 王飛.低致病性禽流感病毒感染人的機制研究[D].北京：中國農業大學，2015.

[12] 孫增輝，朱銀川，王熹婧，等.H6N1亞型禽流感病毒跨種屬傳播研究進展[J].中國人獸共患病學報，2017，33（3）：236-240.

[13] 黎玉蓮.2株H5N6亞型禽流感病毒的序列分析和致病性研究[D].廣州：華南農業大學，2016.

[14] 祁思敏，宋勇春，崔侖標，等.1株H6N6亞型禽流感病毒分子遺傳特性分析[J].微生物與感染，2017，12（5）：287-293.

[15] 張爍，林宏文，袁潤余，等.H6N6亞型禽流感病毒廣東分離株分子遺傳演化分析[J].畜牧獸醫學報，2014，45（6）：989-996.

[16] PENG Y，XIE Z X，LIU J B，et al.Epidemiological surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus （LPAIV） from poultry in Guangxi Province，Southern China[J].PLoS One，2013，8（10）：1-7.

[17] HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J].Arch Virol，2001，146：2275-2289.

[18] 張蔚，施一.禽流感病毒跨種傳播的分子機制[J].生命科學，2015，27（5）：539-548.

[19] 顧敏，彭大新，劉秀梵.我國H9N2亞型禽流感病毒的流行和進化特點[J].生命科學，2015，27（5）：531-538.

[20] 李曉丹，張燁，鄒淑梅，等.高致病性A（H5N6）亞型禽流感病毒全基因組序列測定方法的建立[J].病毒學報，2017，33（1）：19-23.

[21] 王熹婧.雞源禽流感病毒H6N6亞型對小鼠致病性以及在豬和人呼吸道組織復制的研究[D].南寧：廣西醫科大學，2019.

[22] 丁晴微，鄧國華，施建忠，等.兩株鴨源H6N2亞型禽流感病毒的序列分析及對雞的致病性研究[J].中國預防獸醫學報，2011，33（4）：270-275.

[23] 熊文婕，謝芝勛，曹國敏，等.2016～2017年防城港市活禽市場低致病性禽流感病毒監測分析[J].中國家禽，2018，40（9）：70-72.

[24] 徐曉龍，包紅梅，陳化蘭，等.影響禽流感病毒致病性和傳播的關鍵氨基酸位點的研究進展[J].中國預防獸醫學報，2014，36（2）：165-168.

基金項目 廣西科技重大專項（桂科AA17204057）;廣西科技基地和人才專項項目（桂科AD17195083）;廣西“八桂學者”專項 （2019-79）;國家“萬人計劃”領軍人才專項（2016-37-88）。

作者簡介 李孟（1981—），男，河南南陽人，副研究員，博士，從事病原分子生物學研究。*通信作者，研究員，從事預防獸醫學研究。

收稿日期 2020-03-22