維氏氣單胞菌感染異育銀鯽基因表達(dá)譜分析

施秀　張婷婷　貢成良　曹廣力　薛仁宇　張星　胡小龍

摘要 [目的] 探討異育銀鯽在維氏氣單胞菌感染的條件下腎臟組織基因表達(dá)譜。[方法]運(yùn)用RNA-sequencing技術(shù)分析健康和感染維氏氣單胞菌的異育銀鯽腎臟組織中mRNA表達(dá)水平的變化。[結(jié)果] 通過(guò)比較維氏氣單胞菌感染組與健康對(duì)照組異育銀鯽腎臟組織基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌感染后11 567個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，其中5 634個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)，5 933個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)。對(duì)所有差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行功能注釋?zhuān)℅O）分析，發(fā)現(xiàn)1 325個(gè)DEGs含有GO注釋?zhuān)渲猩险{(diào)和下調(diào)表達(dá)基因分別為581和744個(gè);GO注釋結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)基因主要富集于RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性、Ⅱ型特異性脫氧核糖核酸酶活性、內(nèi)切酶活性等;下調(diào)表達(dá)基因主要富集于吡哆醛結(jié)合、肽酶抑制劑活性和RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性等。對(duì)所有DEGs進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)545個(gè)DEGs（215個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，330個(gè)下調(diào)表達(dá)基因）含有KEGG注釋;上調(diào)表達(dá)基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、抗原加工和呈現(xiàn)和雌激素信號(hào)通路等KEGG通路;下調(diào)表達(dá)基因富集通路主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞黏附分子和jak-STAT信號(hào)通路等KEGG通路。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其與RNA-sequencing結(jié)果具有相似的表達(dá)趨勢(shì)。[結(jié)論] 這些研究結(jié)果可為后續(xù)解析異育銀鯽對(duì)A.veronii感染的發(fā)病機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 維氏氣單胞菌;異育銀鯽;表達(dá)譜

中圖分類(lèi)號(hào) S 943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）23-0131-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.032

Gene Expression? Pattern Analysis of Carassius auratus gibelio Infected by Aeromonas veronii

SHI Xiu， ZHANG Ting-ting， GONG Cheng-liang et al

（School of Biology & Basic Medical Sciences， Soochow University， Suzhou， Jiangsu 215123）

Abstract [Objective] The purpose of this study was to explore the mRNA expression pattern in the kidney tissues of Carassius auratus gibelio infected by? Aeromonas veronii. [Method] RNA-sequencing was applied to analyze the gene expression pattern in the kidney tissues of healthy C. auratus gibelio and C. auratus gibelio infected by A. veronii. [Result] Through comparing the gene expression differences of kidney tissues of C. auratus gibelio in healthy group and A. veronii infection group， it was found that the expression level of 11 567 genes had significant changes， 5 634 genes were up-regulated and 5 933 genes were down-regulated .Through functional annotation （GO） analysis of all differentially expressed genes （DEGs）， it was found that 1 325 in all DEGs had GO terms， containing 581 up-regulated genes and 744 downregulated genes. GO annotation results showed that? upregulated genes were enriched into the RNA-directed DNA polymerase activity，Type Ⅱ site-specific deoxyribonuclease activity and endonuclease activity，and downregulated genes were enriched into pyidoxal binding， peptidase inhibitor activity and RNA-directed DNA polymerase activity. Through KEGG pathway analysis of all DEGs， it was found that 545 DEGs （215 up-regulated genes and 330 down-regulated genes） contained KEGG annotations. Upregulated genes were enriched into the KEGG pathways of protein processing in endoplasmic reticulum， antigen processing and presentation and esterogen signaling pathway，? wherein， downregulated genes were enriched into the KEGG pathways of cytokine-cytokine receptor interaction， cell adhesion molecules and jak-STAT signaling pathway. The expression levels of several genes were selected to validate by real-time PCR and the results showed that they had the similar expression tendency.? [Conclusion] These results could provide reference data for the subsequent analysis of the pathogenesis of A. veronii infection in C. auratus gibelio.

Key words Aeromonas veronii;Carassius auratus gibelio;Expression pattern

鯽魚(yú)（異育銀鯽）作為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)品種之一，其適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、人工養(yǎng)殖簡(jiǎn)單及其營(yíng)養(yǎng)豐富和肉味鮮美，深受消費(fèi)者的青睞，其養(yǎng)殖量約占全國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量的10.67%[1]。隨著規(guī)模化、節(jié)約化養(yǎng)殖模式的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)因養(yǎng)殖過(guò)程中所發(fā)生的因病原體感染造成的經(jīng)濟(jì)損失日益加劇。出血性敗血癥對(duì)鯽魚(yú)養(yǎng)殖的影響非常大，目前認(rèn)為鯽魚(yú)出血性敗血癥由鯉皰疹Ⅱ型病毒（CyHV-2）感染和細(xì)菌（維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌）感染引起，其中前者致病性強(qiáng)，致死率高，發(fā)展迅速、短時(shí)間內(nèi)可造成大規(guī)模的鯽魚(yú)死亡;后者發(fā)病過(guò)程相對(duì)溫和。關(guān)于CyHV-2造成的鯽魚(yú)出血性敗血癥已有諸多報(bào)道[2-4]，但關(guān)于維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）導(dǎo)致的鯽魚(yú)出血性敗血癥的報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解甚少。

目前，高通量測(cè)序技術(shù)已發(fā)展成熟，此技術(shù)已經(jīng)在大量物種中開(kāi)展了基因時(shí)空表達(dá)研究，此技術(shù)能夠快速獲得某物種在特定條件下整體基因表達(dá)水平的變化，為整體認(rèn)識(shí)物種中基因表達(dá)調(diào)控提供了重要的技術(shù)手段。RNA-sequencing技術(shù)在魚(yú)類(lèi)免疫研究中也得到了廣泛應(yīng)用，例如研究草魚(yú)呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）感染草魚(yú)后基因表達(dá)差異[5];淋巴囊腫病毒（lymphocystis disease virus，LCDV）感染牙鲆（Paralichthys olivaceus）后基因表達(dá)差異[6];傳染性鮭魚(yú)貧血癥病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）感染大西洋大馬哈魚(yú)（Salmo salar）后基因表達(dá)差異[7];鯉春病毒血癥病毒（spring viremia of carp virus，SVCV）感染斑馬魚(yú)（Danio rerio）后基因表達(dá)差異[8]等;安圭拉弧菌（Vibrio anguillarum）感染大菱鲆（Scophthalmus maximus）后腸道的基因表達(dá)差異[9];嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染鈍口鯛（Megalobrama amblycephala）后腎組織的基因表達(dá)差異[10];嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染金馬西爾（Tor putitora）后肝臟的基因表達(dá)差異[11];愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染黃鯰魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）后脾臟組織的基因表達(dá)差異[12]等。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，讓人們從整體水平上認(rèn)識(shí)在病原體感染的情況下宿主細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)譜特征變化。

筆者利用RNA-sequencing技術(shù)研究了維氏氣單胞菌感染異育銀鯽的腎組織中基因的表達(dá)模式，比較分析了維氏氣單胞菌感染和未感染異育銀鯽腎臟組織中基因表達(dá)模式的異同，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能注釋和信號(hào)通路分析，旨在為探索異育銀鯽對(duì)維氏氣單胞菌的感染應(yīng)答機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康異育銀鯽采樣于江蘇省昆山市澄湖水產(chǎn)良種場(chǎng)，體重約30 g/尾，在充氧條件下按照常規(guī)飼養(yǎng)條件進(jìn)行人工飼養(yǎng)。維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，來(lái)源于自然發(fā)病的異育銀鯽，通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行物種鑒定。隨機(jī)選取3尾健康異育銀鯽進(jìn)行腹腔注射，發(fā)病后取其腎臟組織作為試驗(yàn)組A2;取3尾健康異育銀鯽的腎臟組織作為對(duì)照組B。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 。

利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit（Ambion-1561）試劑盒提取試驗(yàn)組和對(duì)照組腎臟組織樣本中總RNA;高質(zhì)量的RNA構(gòu)建測(cè)序文庫(kù);構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢分析;使用Illumina HiSeqTM 4000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。RNA-sequencing測(cè)序委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估。

HiSeqTM 4000測(cè)序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)raw reads，進(jìn)行過(guò)濾處理獲得clean reads。為了避免樣本污染，隨機(jī)從每個(gè)樣本中抽取25萬(wàn)對(duì)reads與數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp：∥ftp.ncbi.nih.gov/blast/db）進(jìn)行比對(duì)，分析統(tǒng)計(jì)序列來(lái)源。

1.2.3 De novo測(cè)序。

利用Trinity（trinityrnaseq_r20131110）軟件[13]的paired-end拼接法，將clean reads拼接為轉(zhuǎn)錄本序列;通過(guò)序列相似性和長(zhǎng)度綜合分析，選取一條最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本序列作為unigene;運(yùn)用TGICL2.1軟件[14]聚類(lèi)去冗余，獲得最終的unigene，de novo拼接所產(chǎn)生的unigene作為后續(xù)分析的參考序列。

1.2.4 基因功能的注釋。

通過(guò)Blastx工具將所有獲得的unigene序列分別與數(shù)據(jù)庫(kù)NR、SWISSPROT和KOG比對(duì)，選取e值<10-5的注釋?zhuān)@得與unigene具有序列相似性最高的蛋白;利用KAAS（http：∥www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main）軟件分析unigene所涉及的KEGG信息;根據(jù)SWISSPROT注釋結(jié)果，得到unigene的GO功能注釋信息。

1.2.5

Unigene表達(dá)豐度。

使用bowtie2 [15]和eXpress[16] 軟件分析unigene在試驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中的表達(dá)水平。使用FPKM法（fragments per kilobase per million reads）計(jì)算unigene的表達(dá)水平[17]。

1.2.6 篩選差異基因（DEGs）。

利用DESeq軟件[18]計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中基因表達(dá)水平差異，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05且差異倍數(shù)（fold change）>2。

1.2.7 DEGs的功能注釋?zhuān)℅O）和KEGG富集分析。

利用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算每個(gè)GO條目中差異表達(dá)基因富集的顯著性。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[19]對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，并用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)Pathway條目中差異基因富集的顯著性。

1.2.8 Real-time PCR。

為了驗(yàn)證RNA-sequencing數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取5個(gè)顯著差異表達(dá)的mRNA[IL-11（IL）、C型溶菌酶（ctl）、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子受體（ILG）、白細(xì)胞介素-13受體（ILR）、toll樣受體-9（TLR）]進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證。從試驗(yàn)組和對(duì)照組腎臟組織樣本中提取總RNA，DNAse Ⅰ 消化后的總RNA用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR操作按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Real-time PCR所用定量引物見(jiàn)表1。基因相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)與de novo數(shù)據(jù)拼接

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)組A2和對(duì)照組B所構(gòu)建的2個(gè)文庫(kù)進(jìn)行RNA-sequencing測(cè)序獲得raw bases，經(jīng)過(guò)濾后得到clean reads，統(tǒng)計(jì)顯示clean reads占raw bases的比例約98%（表2）。隨機(jī)從試驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中抽取25萬(wàn)對(duì)reads與數(shù)據(jù)庫(kù)（nt）比對(duì)，分析序列的物種來(lái)源。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組A2樣本中reads匹配的前10物種僅為異育銀鯽或其近緣物種，對(duì)照組B樣本中reads匹配的前10物種也為異育銀鯽或其近緣物種，及A.veronii（圖1A、B）。以上研究結(jié)果表明，2個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高質(zhì)量，且不存在其他微生物污染。為便于后續(xù)的研究和應(yīng)用，測(cè)序的原始數(shù)據(jù)均已保存在NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)SRA（SRR8259812和SRR8259811）。通過(guò)對(duì)unigene的數(shù)量與長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，共獲得220 374個(gè)unigene，平均長(zhǎng)度為818.04 bp（圖1C）。將檢測(cè)到的unigene進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)物種信息匹配，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組注釋的親緣物種top5依次為犀角金線魮（12 722個(gè)unigene，占25.83%）、鯉魚(yú)（9 915個(gè)unigene，占20.13%）、安水金線鲃（8 727個(gè)unigene，占17.72%）、金線鲃（5 901個(gè)unigene，占11.98%）、斑馬魚(yú)（2 878個(gè)unigene，占5.84%）（圖1D）。

2.2 unigene功能注釋

為了全面了解所有unigene的潛在功能，將獲得的unigene分別與5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、SWISSPROT、KOG、GO和KEGG）進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示NR數(shù)據(jù)庫(kù)中存在49 248個(gè)unigene、SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)含有32 191個(gè)unigene、KOG數(shù)據(jù)庫(kù)存在24 369個(gè)unigene、GO數(shù)據(jù)庫(kù)含有28 873個(gè)unigene和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)含有13 330個(gè)unigene（表3）。

將所有unigene進(jìn)行GO注釋后歸類(lèi)到生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三大類(lèi)，并進(jìn)一步細(xì)分至64個(gè)亞類(lèi)中。試驗(yàn)組樣本中的unigene注釋至BP有164 430個(gè)（50.55%），注釋至CC有121 189個(gè)（37.26%），注釋至MF有39 670個(gè)（12.20%）（圖2A）。將所有unigene進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示所有unigene主要分為細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類(lèi)疾病、代謝和有機(jī)系統(tǒng)6個(gè)代謝途徑，進(jìn)一步分析顯示這些unigene參與42個(gè)KEGG信號(hào)通路。試驗(yàn)組樣本中發(fā)現(xiàn)13 330個(gè)unigene含有KEGG注釋?zhuān)渲衭nigene主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（9 357個(gè)unigene）、感染性疾病（6 003個(gè)unigene）和癌癥（5 966個(gè)unigene）等相關(guān)通路（圖2B）。

2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

根據(jù)差異表達(dá)基因（DEGs）篩選要求P<0.05且差異倍數(shù)（fold change）>2，比較了試驗(yàn)組樣本和對(duì)照組樣本中mRNA的表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)11 567個(gè)DEGs，其中5 634個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)和5 933個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)。根據(jù)DEGs繪制火山圖（圖3），通過(guò)火山圖可以直觀地了解試驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中基因的差異表達(dá)情況。

2.4 DEGs的GO注釋分析

通過(guò)試驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中基因表達(dá)水平比較以及GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)1 325個(gè)DEGs存在GO注釋?zhuān)渲蟹謩e包括581上調(diào)表達(dá)基因和744個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。GO注釋分析顯示上調(diào)表達(dá)基因主要富集于RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RNA-directed DNA polymerase activity）、Ⅱ型特異性脫氧核糖核酸酶活性（Type Ⅱ site-specific deoxyribonuclease acitvity）和內(nèi)切酶活性（endonuclease activity）等（圖4A）;下調(diào)表達(dá)基因主要富集于吡哆醛結(jié)合（pyidoxal binding）、肽酶抑制劑活性（peptidase inhibitor activity）和RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RNA-directed DNApolymerase activity）等（圖4B）。

2.5 DEGs的KEGG富集分析

通過(guò)試驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中基因表達(dá)水平比較以及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)有545個(gè)DEGs參與KEGG信號(hào)通路，其中包括215個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和330個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。上調(diào)表達(dá)基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、抗原加工和呈現(xiàn)（antigen processing and presentation）和雌激素信號(hào)通路（esterogen signaling pathway）等KEGG通路（圖5A）;下調(diào)表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules）和jak-STAT信號(hào)通路（jak-STAT signaling pathway）等KEGG通路（圖5B）。

2.6 Real-time PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-sequencing數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取5個(gè)基因（IL-11、C型溶菌酶、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子受體、白細(xì)胞介素-13受體和toll樣受體-9基因）進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示Real-time PCR結(jié)果與RNA-sequencing數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)相一致（圖6）。

3 討論

鯽魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中遭受多種病原菌的感染，維氏氣單胞菌是其中的一種，此類(lèi)細(xì)菌的感染會(huì)造成鯽魚(yú)出血性敗血癥，嚴(yán)重?fù)p傷腎臟組織，造成壞死和解體等病理現(xiàn)象。該研究利用維氏氣單胞菌感染異育銀鯽腎臟組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，以期從基因表達(dá)調(diào)控方面明晰異育銀鯽對(duì)維氏氣單胞菌感染的免疫應(yīng)答。由于異育銀鯽的遺傳背景中的基因組信息不清楚，利用de novo測(cè)序技術(shù)，拼接完成了異育銀鯽的轉(zhuǎn)錄組水平遺傳信息，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了維氏氣單胞菌感染和未感染異育銀鯽之間的差異轉(zhuǎn)錄組分析，所獲得的異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組水平的遺傳信息和維氏氣單胞菌感染后的基因表達(dá)差異情況，為后續(xù)的解析異育銀鯽對(duì)維氏氣單胞菌感染的發(fā)病機(jī)制提供參考數(shù)據(jù)。

de novo測(cè)序和序列拼接結(jié)果顯示共發(fā)現(xiàn)220 374個(gè)unigene，其中57 200條unigene來(lái)源于維氏氣單胞菌，163 174條unigene來(lái)源于異育銀鯽。通過(guò)對(duì)163 174條unigene進(jìn)行GO注釋和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)這些unigene涉及異育銀鯽的生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)及免疫等;KEGG分析結(jié)果也顯示這些unigene參與重要的信號(hào)通路（如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、先天免疫和后天免疫信號(hào)通路等），說(shuō)明低等脊椎動(dòng)物異育銀鯽也具備完整的免疫系統(tǒng)。

嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的且也是危害嚴(yán)重的病原體。目前，利用A.hydrophila感染各種魚(yú)類(lèi)研究宿主的免疫應(yīng)答的研究較多，認(rèn)識(shí)也比較的清晰。Song等[20]利用高通量測(cè)序技術(shù)比較了A.hydrophila感染和未感染的草魚(yú)腸道組織中基因表達(dá)差異情況，共檢測(cè)到315個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和234個(gè)下調(diào)表達(dá)基因;在感染A.hydrophila的大黃魚(yú)中，利用高通量測(cè)序技術(shù)共檢測(cè)到727個(gè)基因表達(dá)上調(diào)和489個(gè)基因表達(dá)下調(diào)[21]。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)溫和氣單胞菌（A.sobria）感染的鯉魚(yú)，結(jié)果顯示在感染的肌肉組織中共檢測(cè)到7 749個(gè)DEGs，其中6 300個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和1 449個(gè)下調(diào)表達(dá)基因;在脾臟組織中共檢測(cè)到7 846個(gè)DEGs，其中5 111個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和2 735個(gè)下調(diào)表達(dá)基因[22]。該研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序維氏氣單胞菌感染的異育銀鯽腎臟組織，共發(fā)現(xiàn)11 567個(gè)DEGs，其中5 634個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和5 933個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。這些研究結(jié)果表明不同種類(lèi)的魚(yú)在細(xì)菌感染后，其基因轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生了明顯變化。Li等[23]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析維氏氣單胞菌感染非洲鯰魚(yú)（Clarias gariepinus）后不同時(shí)間時(shí)相脾臟組織基因表達(dá)模式情況，共發(fā)現(xiàn)2 482個(gè)DEGs，其明顯低于維氏氣單胞菌感染異育銀鯽中的DEGs數(shù)量，也說(shuō)明不同種類(lèi)的魚(yú)對(duì)A.veronii感染的基因表達(dá)水平差異及應(yīng)答反應(yīng)存在明顯不同。Maekawa等[24]利用不同種類(lèi)的魚(yú)感染不同種類(lèi)的細(xì)菌，研究其基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)39個(gè)DEGS存在于所檢測(cè)的加州鱸（Micropterus salmoides）、鯔（Mugil cephalus）、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）中;不同魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的總DEGs也存在顯著差異，這些研究結(jié)果表明不同種類(lèi)的魚(yú)可能存在特定的免疫應(yīng)答相關(guān)通路。

免疫相關(guān)基因irg1l、補(bǔ)體因子D和cfd（NM_001020532.1）在感染中參與應(yīng)答反應(yīng)。Hartig等[25]研究斑馬魚(yú)感染沙門(mén)氏菌1 h后就可檢測(cè)到irg1l上調(diào)表達(dá)，表明該基因?qū)ι抽T(mén)氏菌感染存在一定的迅速應(yīng)答機(jī)制。補(bǔ)體因子D在宿主防御中起重要作用[26]。cfd在牙鲆的各組織中均有表達(dá)，感染病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）后牙鲆肝臟、腎臟、脾臟中的cfd均表達(dá)上調(diào)升高[26]。該研究中irg1l在維氏氣單胞菌感染腎臟組織后下調(diào)至0.006 8倍;cfd在維氏氣單胞菌感染腎臟組織后上調(diào)9.885 1倍。因此，推測(cè)irg1l和cfd在異育銀鯽免疫應(yīng)答和防御過(guò)程中扮演重要角色。

為了能夠了解異育銀鯽對(duì)維氏氣單胞菌感染的應(yīng)答，將篩選出的DEGs進(jìn)行富集分析。KEGG富集分析顯示維氏氣單胞菌感染后的上調(diào)表達(dá)基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、抗原加工和呈現(xiàn)（antigen processing and presentation）和雌激素信號(hào)通路（esterogen signaling pathway）等KEGG通路;下調(diào)表達(dá)基因富集通路主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules）和jak-STAT信號(hào)通路（jak-STAT signaling pathway）等KEGG通路，研究結(jié)果表明A.veronii感染異育銀鯽后引起了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。Rodríguez等[27]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析斑馬魚(yú)感染A.hydrophila后皮膚的應(yīng)答模式，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集于MAPK、p53、Wnt、TGF-β、Notch、ErbB、JAK-STAT、VEGF、mTOR和鈣信號(hào)等通路。維氏氣單胞菌感染會(huì)的最主要的病理癥狀就是引起異育銀鯽的全身性出血，推測(cè)其可能與VEGF信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，筆者對(duì)異育銀鯽感染維氏氣單胞菌感染后的應(yīng)答模式進(jìn)行了分析，比較了異育銀鯽對(duì)病原體感染的免疫應(yīng)答模式，維氏氣單胞菌感染異育銀鯽中發(fā)現(xiàn)多個(gè)顯著差異表達(dá)基因，這些基因參與了重要的信號(hào)通路，尤其是免疫信號(hào)通路。這些結(jié)果為探索異育銀鯽對(duì)維氏氣單胞菌的感染應(yīng)答機(jī)制提供了線索，為細(xì)菌性出血性敗血癥綜合防治奠定了理論基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目 蘇州大學(xué)第六屆“互聯(lián)網(wǎng)+”大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目;蘇州大學(xué)第十一屆“蘇大天宮杯”“創(chuàng)青春”大學(xué)生創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 施秀（1999—），女， 江蘇南通人，研究方向：基因表達(dá)調(diào)控。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)制研究。

收稿日期 2020-07-09;修回日期 2020-07-24