杜馬斯燃燒法測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)含量

黃世群， 秦 琳， 文 婷， 仲伶俐， 趙 珊， 李 曦， 白 勝

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心， 四川 成都 610066； 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 服務(wù)中心， 四川 成都 610066)

玉米淀粉為白色或微帶淡黃色有光澤細(xì)膩松散粉末，通過(guò)對(duì)玉米清理、浸泡(浸泡水含二氧化硫濃度為0.15%～0.20%)、粗碎、胚芽分離、磨碎、淀粉篩分、離心分離和干燥等一系列工藝流程未經(jīng)改性提取而得。玉米淀粉作為原料或變性后廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、制糖、氨基酸、發(fā)酵、化工、造紙等行業(yè)[1-4]。通常食用玉米淀粉蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法[5-6]，但傳統(tǒng)凱氏定氮儀法測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)前處理時(shí)，由于玉米淀粉吸水性強(qiáng)，細(xì)度細(xì)(干基，150 μm)，加酸后容易結(jié)成團(tuán)塊，浸透不徹底，且與其他食品類相比需更長(zhǎng)的消煮時(shí)間，又因玉米淀粉蛋白質(zhì)含量較低，消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液量少，測(cè)定時(shí)誤差相對(duì)較大，難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，往往需進(jìn)行返工重復(fù)測(cè)定，導(dǎo)致測(cè)定工作效率較低。因此，探索簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的檢測(cè)方法且準(zhǔn)確測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)含量，對(duì)產(chǎn)品準(zhǔn)確定級(jí)具有重要意義。

目前杜馬斯燃燒法廣泛應(yīng)用于各類食品檢測(cè)中。王欽權(quán)等[7]以各類常見(jiàn)的食品為材料,分別采用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，并對(duì)檢測(cè)原理、步驟及精密度、準(zhǔn)確度、回收率進(jìn)行對(duì)比研究。汪紅等[8]以芝麻、大豆、油菜和花生為研究對(duì)象，分別用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測(cè)定4種樣品的粗蛋白含量,結(jié)果2種方法的測(cè)定值間沒(méi)有顯著性差異,但杜馬斯燃燒法比凱氏定氮法的測(cè)定精密度和準(zhǔn)確度更高。楊雪嬌等[9]用杜馬斯法和凱氏法以各類食品為試驗(yàn)材料測(cè)定其含氮量，其中大部分食品樣品杜馬斯法和凱氏法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差別。張秀蓮等[10]分別采用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測(cè)定14個(gè)人參樣品的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示2種測(cè)定方法測(cè)得的人參蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P>0.05)。目前，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)玉米淀粉蛋白質(zhì)含量采用杜馬斯燃燒法進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道。鑒于此，采用杜馬斯燃燒法對(duì)玉米淀粉蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，并與凱氏定氮儀法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析,旨在為玉米淀粉蛋白質(zhì)含量測(cè)定開(kāi)辟新的更可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米淀粉樣品 玉米淀粉樣品為2019年四川省不同地區(qū)委托四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心檢測(cè)的隨機(jī)抽取的26個(gè)玉米淀粉樣品(編號(hào)為1～26)，樣品均能滿足檢測(cè)要求。

1.1.2 主要儀器 rapid MAX N EXCEED 元素分析儀(德國(guó)Elementar 公司)，AUY 220電子天平(精度為0.0001 g)，自動(dòng)Kjeltec定氮儀(瑞典，型號(hào)FOSS2400)，消化爐(瑞典FOSS公司)。

1.1.3 主要試劑 混合催化劑，無(wú)水硫酸銅+硫酸鉀(3︰97)；濃硫酸，20 g/L 硼酸溶液，400 g/L氫氧化鈉溶液，0.0501 5 mol /L硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，混合指示劑(0.1%甲基紅乙醇溶液，0.1%溴甲酚綠乙醇溶液7 mL∶10 mL/L硼酸溶液)[11]，氧化銅，Pt催化劑，ESA-REGAINER，氧化鋁球，氫氧化鈉(黑色顆粒狀)，五氧化二磷。

1.1.4 氣體 氧氣(純度≥99.99%)，氦氣(純度≥99.99%)。

1.1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 天冬氨酸(N 10.52%，純度≥98%)，乙酰苯胺(N 10.15%，純度≥98%)，硫酸銨(N 21.21%，純度≥98%)；小麥粉(蛋白質(zhì)15.8%±0.3%)，土壤標(biāo)準(zhǔn)品(N 0.081%±0.012%)。

1.2 方法

采用杜馬斯燃燒法和自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定26個(gè)玉米淀粉樣品的蛋白質(zhì)含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次(其中，樣品7進(jìn)行23次重復(fù)測(cè)定)，并對(duì)2種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.1 自動(dòng)凱氏定氮儀法 稱取1 g玉米淀粉，精確至0.000 1 g，倒入凱氏消化管中加入10 g催化劑〔五水合硫酸銅+硫酸鉀(3︰97)〕，搖勻，加12 mL硫酸后再搖至樣品完全浸透，放置2 h后置于消化爐上加熱升溫，當(dāng)消化爐溫度達(dá)420℃進(jìn)行消化1.5 h[11-12]，停止升溫并提起消煮架，可觀察到測(cè)試樣品呈綠色透明狀，待降溫后緩慢加入約40 mL去離子水，待稀釋液體冷卻后，置于FOSS2400全自動(dòng)凱氏定氮儀上進(jìn)行測(cè)定。儀器設(shè)置條件：硼酸溶液40 mL(內(nèi)混有指示劑)，氫氧化鈉溶液70 mL，蒸餾時(shí)間3.5 min，蒸餾同時(shí)儀器自動(dòng)用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)液體顏色滴定至淺灰紅色時(shí)，滴定終止，儀器自動(dòng)記錄滴定體積?？瞻自囼?yàn)，通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乙酰苯胺和硫酸銨并根據(jù)測(cè)定值確定儀器處于正常狀態(tài)后，進(jìn)行玉米淀粉樣品測(cè)定。結(jié)果以全氮含量×6.25所得值為玉米淀粉蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 杜馬斯燃燒法 稱取玉米淀粉1 g，精確至0.000 1 g，倒入儀器專用坩堝內(nèi)，將坩堝放入進(jìn)樣盤(pán)中的對(duì)應(yīng)孔位號(hào)中。開(kāi)啟rapid MAX N EXCEED型元素分析儀，并打開(kāi)系統(tǒng)軟件，當(dāng)燃燒管溫度達(dá)900℃以上、次級(jí)燃燒管接近900℃、TCD檢測(cè)器溫度升至59℃時(shí)，同時(shí)滿足氧氣壓力達(dá)0.25 MPa、氦氣壓力達(dá)0.38 MPa條件下，元素分析儀可以正常運(yùn)行?？瞻自囼?yàn)，稱取標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)天冬氨酸10.8 mg、80.6 mg、150.0 mg、200.3 mg、250.3 mg和302.7 mg，上機(jī)檢測(cè)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過(guò)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小麥粉和土壤標(biāo)準(zhǔn)品并根據(jù)其含量確定儀器處于正常狀態(tài)并得出日校正因子，再進(jìn)行供試樣品測(cè)定。輸入被測(cè)樣品稱樣量、名稱、校正因子及氮換算成蛋白質(zhì)系數(shù)6.25，儀器設(shè)置條件：加氧時(shí)間120 s、加氧流速300 mL/min，每個(gè)單樣出峰到積分完成時(shí)間為6 min，樣品燃燒的同時(shí)儀器自動(dòng)積峰，根據(jù)峰面積得出氮含量，儀器自動(dòng)計(jì)算出被測(cè)樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，采用EXCEL進(jìn)行線性回歸分析，P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和精密度

2.1.1 穩(wěn)定性 自動(dòng)凱氏定氮儀法標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用乙酰苯胺，乙酰苯胺量為17.6～61.1 mg，總氮含量為1.786～6.214 mg，以乙酰苯胺量為橫坐標(biāo)，總氮含量為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)為y=0.102 1x-0.016 3(R2=0.999 9)。杜馬斯燃燒法標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用天冬氨酸，總氮含量為1.136～ 31.844 mg，N的峰面積在3 066～81 576，以總氮含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)為y=2 559.9x+335.35(R2=1)。2種方法的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱樣量與測(cè)定值存在顯著的線性相關(guān)(R2≥0.999 9)，說(shuō)明方法均穩(wěn)定。

2.1.2 精密度 從表1看出，2種方法對(duì)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果都接近于真實(shí)值。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和相對(duì)誤差(RE)杜馬斯燃燒法較自動(dòng)凱氏定氮儀法均低，說(shuō)明杜馬斯燃燒法精密度更高，準(zhǔn)確度更好。

表1 自動(dòng)凱氏定氮儀法和杜馬斯燃燒法測(cè)定3種物質(zhì)的含量(n=5)

2.2 2種方法測(cè)定的玉米淀粉蛋白質(zhì)含量

2.2.1 對(duì)同一玉米淀粉樣品的重復(fù)測(cè)定 對(duì)樣品7進(jìn)行23次重復(fù)蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果(圖3)表明，自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量為0.247%～0.272%，最大相差0.025百分點(diǎn)；杜馬斯燃燒法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量為0.257%～0.285%，最大相差0.028百分點(diǎn)。在23次測(cè)定中，2種方法的測(cè)定值完全一致的有1次，自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定值高于杜馬斯燃燒法的有2次，其余20次杜馬斯燃燒法測(cè)定值均略高于自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定值(占比87.0%)。

2.2.2 對(duì)26個(gè)玉米淀粉樣品的測(cè)定 從表2看出，2種測(cè)定方法中，均表現(xiàn)為樣品15和樣品19與其他樣品差異顯著，其余24個(gè)樣品的差異均不顯著，表明2種測(cè)定方法的一致性較高。凱氏定氮法的RSD值為0.51%～4.64%，杜馬斯燃燒法的RSD值為0.52%～3.60%，均小于5%，說(shuō)明2種方法精密度較高，穩(wěn)定性較好。K/D值(凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法測(cè)定值的比值)除樣品15和樣品19差異顯著外，其余24個(gè)樣品差異不顯著，K/D值均為0.931～1.055(接近1)，進(jìn)一步說(shuō)明2種方法的測(cè)定值較一致。

表2 杜馬斯燃燒法與自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定的26個(gè)樣品的玉米淀粉蛋白質(zhì)(n=3)

3 結(jié)論與討論

GB/T8885-2017《食用玉米淀粉》中規(guī)定，食用玉米淀粉的蛋白質(zhì)測(cè)定方法按GB/T22427.10-2008《淀粉及其衍生物氮含量測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)中凱氏定氮法[5-6]。但實(shí)踐證明，采用傳統(tǒng)凱氏定氮儀法測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)存在以下不足：一是前處理時(shí)由于玉米淀粉吸水性強(qiáng)，細(xì)度細(xì)(為150 μm)(干基)加酸后非常容易結(jié)成團(tuán)塊，浸透不徹底；二是與其他食品類相比需要消煮的時(shí)間更長(zhǎng)；三是由于玉米淀粉蛋白質(zhì)含量較低，消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液量少，導(dǎo)致誤差相對(duì)較大等。因此，開(kāi)展了杜馬斯燃燒法測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)的可行性研究。結(jié)果表明，杜馬斯燃燒法和自動(dòng)凱氏定氮儀法2種方法均能準(zhǔn)確測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)含量，測(cè)定樣品時(shí)精密度和準(zhǔn)確度均能滿足試驗(yàn)要求。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)杜馬斯燃燒法方法更穩(wěn)定，測(cè)定值更接近真值，誤差更小，回收率高。同時(shí)，杜馬斯燃燒法方便、快速、環(huán)保、省時(shí)省工，僅需稱量后依次燃燒，不消煮、不用溶液滴定，只需更換耗材，完全避免了自動(dòng)凱氏定氮儀法因樣品浸透硫酸不完全而消煮時(shí)糊化、消化不徹底、消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液體積小導(dǎo)致誤差、配制各種溶液和指示劑耗時(shí)長(zhǎng)用工多等缺點(diǎn)[13]。

2種方法相比，杜馬斯燃燒法測(cè)定的玉米淀粉蛋白質(zhì)含量略高于自動(dòng)凱氏定氮儀法，一方面可能是由于杜馬斯燃燒法的燃燒完全，另一方面可能因?yàn)橛衩椎矸酆袠O少量的二氧化硫(SO2)，SO2屬于弱還原劑，溶于水后生成亞硫酸(H2SO3)，然后亞硫酸再跟氫氧化鈉(NaOH)反應(yīng)，酸堿中和，這樣容易導(dǎo)致元素分析儀吸收管內(nèi)的NaOH消耗較快，一旦更換不及時(shí)將導(dǎo)致吸收不完全，儀器會(huì)誤將SO2作為N計(jì)入峰面積致使測(cè)定值增大。因此，在采用杜馬斯燃燒法測(cè)定玉米淀粉蛋白質(zhì)過(guò)程中，一定要關(guān)注吸收管內(nèi)吸收劑NaOH的變色情況并及時(shí)更換，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。