禽流感血凝和血凝抑制試驗操作

魯衛紅/甘肅省臨夏州動物疫病預防控制中心 731100

1 實驗操作準備要點

1.1 標本處理和保存血凝和血凝抑制試驗主要以靜脈血為主。要使實驗室診斷得出正確結果，采集靜脈血后需要及時做血清分離，保證血清清透無溶血。通常是分離后及時檢測，如果不能及時檢測，待檢血清在4℃冷藏環境中保存不超過5d，如果待檢時間超過一周，需要保存在-20℃冷凍環境中，檢測時取出自然融化，避免血清反復凍融影響效價。

1.2 稀釋液配置血凝和血凝抑制試驗中所用的PBS稀釋液必須遵循“現配現用”的原則，嚴格控制PBS液的PH值確保PH7.0～7.2。

1.3 1%紅細胞懸液制備需要選取3～5只常規實驗證明體內無禽流感病毒抗體的健康公雞，最大限度的避免公雞紅細胞發生自凝現象。翅下靜脈血采集到加有抗凝劑的試管中并上下顛倒混勻，待采集樣本在離心操做中緩慢加入PBS液混合，按2000r/min的離心5min，反復三次離心即可，每次離心結束后都吸出上層溶液和白細胞膜棄去，制成紅細胞泥加入阿氏保護液，4℃冷藏保存備用，不超過5d。整個制備過程中避免用力太大引發紅細胞破裂出現溶血現象，臨用時用PBS液制成1%紅細胞懸液，每次實驗結束后剩余的1%紅細胞懸液應棄去，切勿保留至下次再用。注意：最終配置好的懸液靜放后出現了紅色上清液，是出現了溶血現象，此時的紅細胞懸液不可用。

2 試驗操作要點

2.1 HA試驗HA試驗主要是測定抗原的效價，通常做3個重復就可以精準得出抗原效價。加入1%紅細胞懸液后在室溫（18～20℃）靜置40min后觀察試驗結果。傾斜反應板，觀察試驗后紅細胞是否存在淚滴狀流淌。能夠完全讓紅細胞凝集的抗原最高稀釋度是該種抗原的血凝效價，該效價為1個血凝單位。HA試驗主要是對血凝效果進行初步判斷，結合判定結果開展4HAU抗原檢測，校正最終檢驗結果。配制好4個HAU的病毒抗原后，需做血凝回歸實驗4孔4個重復，其結果判定如下：

如果HA效價判定精準，4HAU抗原檢測時回滴到第一二孔時將發生凝集，在后面兩孔將出現流淌現象；如果HA效價判定出現偏差，4HAU抗原檢測時濃度將出現偏高或者偏低。當4HAU抗原濃度偏低時候需要添加抗原，當4HAU抗原濃度偏高時需要補充一定的PBS

2.2 HI試驗在HI試驗時需要設立陰性和陽性對照組。操作過程中為了減少誤差，不論是在HA或HI實驗中倍比稀釋時保持每次稀釋次數盡量一致（5～8次），稀釋時吸頭插入液面以下但不可過深，避免孔中液體產生氣沫，倍比稀釋后再加任何液體全部采用先加對照孔，其次按低濃度孔向高濃度孔順序添加，需要遵循“從后往前”加原則。加入抗原后在室溫（18～20℃）條件下靜置30min，再添加1%紅細胞懸液，在加抗原和紅細胞懸液時吸頭不要深入液面，盡量懸空垂直加樣。加入紅細胞后需要混勻（反應板四邊輕輕手拍20次，嚴禁使用震蕩器混勻），避免紅細胞下沉。每次靜置時反應板需封口，以免水分蒸發影響結果，孵育時間要嚴格控制。紅細胞對照完全沉淀時迅速判定，可將反應板傾斜45°。判定最高稀釋度時需要結合紅細胞對照孔，與對照孔的流淌速度一致，淚滴大小一致的稀釋倍數孔為檢測樣品的最終效價。整個實驗過程中要避免雜菌污染，因為污染所造成的非流感性的凝集素也可與所有抗原血清發生非特異性反應。

2.3 結果判定試驗結果將出現病毒對照孔完全凝集和稀釋液對照孔無凝集。

2.3.1 如果出現整板無紅細胞凝集（流淌）現象，首先考慮：a未加4單位抗原或4單位抗原配制過低。b 環境溫度過高或讀數時間拖延。

2.3.2 出現整板紅細胞凝集（不流淌）現象，原因有：a紅細胞、PBS液受污染或保存時間過長。b 4HAU抗原配制失敗或滴加失誤。只有陰性對照孔血清滴度≦2log2，并且陽性對照孔血清誤差±1個滴度的時候該項試驗結果才具有可參考性。測定孔血凝抑制試驗效價以完全血凝抑制4HAU抗原血清的最高稀釋倍數為基數，將基數作為HI的滴讀。即紅細胞沉于孔底中心，呈紐扣狀，將板傾斜呈淚滴狀流淌。禽流感HI價≦2log2判定試驗陰性，HI價等于3log2為可疑，需重復實驗，HI價≥4log2為陽性。

3 結束語

總之，為了確保禽流感血凝和血凝抑制試驗的精準性，必須注重每個實驗細節，嚴格按照實驗標準流程開展，做好試驗環節質量把控。最大限度降低試驗誤差，為預防和控制禽流感得出精準的意見。