禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作

魯衛(wèi)紅/甘肅省臨夏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 731100

1 實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)備要點(diǎn)

1.1 標(biāo)本處理和保存血凝和血凝抑制試驗(yàn)主要以靜脈血為主。要使實(shí)驗(yàn)室診斷得出正確結(jié)果，采集靜脈血后需要及時(shí)做血清分離，保證血清清透無溶血。通常是分離后及時(shí)檢測(cè)，如果不能及時(shí)檢測(cè)，待檢血清在4℃冷藏環(huán)境中保存不超過5d，如果待檢時(shí)間超過一周，需要保存在-20℃冷凍環(huán)境中，檢測(cè)時(shí)取出自然融化，避免血清反復(fù)凍融影響效價(jià)。

1.2 稀釋液配置血凝和血凝抑制試驗(yàn)中所用的PBS稀釋液必須遵循“現(xiàn)配現(xiàn)用”的原則，嚴(yán)格控制PBS液的PH值確保PH7.0～7.2。

1.3 1%紅細(xì)胞懸液制備需要選取3～5只常規(guī)實(shí)驗(yàn)證明體內(nèi)無禽流感病毒抗體的健康公雞，最大限度的避免公雞紅細(xì)胞發(fā)生自凝現(xiàn)象。翅下靜脈血采集到加有抗凝劑的試管中并上下顛倒混勻，待采集樣本在離心操做中緩慢加入PBS液混合，按2000r/min的離心5min，反復(fù)三次離心即可，每次離心結(jié)束后都吸出上層溶液和白細(xì)胞膜棄去，制成紅細(xì)胞泥加入阿氏保護(hù)液，4℃冷藏保存?zhèn)溆茫怀^5d。整個(gè)制備過程中避免用力太大引發(fā)紅細(xì)胞破裂出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，臨用時(shí)用PBS液制成1%紅細(xì)胞懸液，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剩余的1%紅細(xì)胞懸液應(yīng)棄去，切勿保留至下次再用。注意：最終配置好的懸液靜放后出現(xiàn)了紅色上清液，是出現(xiàn)了溶血現(xiàn)象，此時(shí)的紅細(xì)胞懸液不可用。

2 試驗(yàn)操作要點(diǎn)

2.1 HA試驗(yàn)HA試驗(yàn)主要是測(cè)定抗原的效價(jià)，通常做3個(gè)重復(fù)就可以精準(zhǔn)得出抗原效價(jià)。加入1%紅細(xì)胞懸液后在室溫（18～20℃）靜置40min后觀察試驗(yàn)結(jié)果。傾斜反應(yīng)板，觀察試驗(yàn)后紅細(xì)胞是否存在淚滴狀流淌。能夠完全讓紅細(xì)胞凝集的抗原最高稀釋度是該種抗原的血凝效價(jià)，該效價(jià)為1個(gè)血凝單位。HA試驗(yàn)主要是對(duì)血凝效果進(jìn)行初步判斷，結(jié)合判定結(jié)果開展4HAU抗原檢測(cè)，校正最終檢驗(yàn)結(jié)果。配制好4個(gè)HAU的病毒抗原后，需做血凝回歸實(shí)驗(yàn)4孔4個(gè)重復(fù)，其結(jié)果判定如下：

如果HA效價(jià)判定精準(zhǔn)，4HAU抗原檢測(cè)時(shí)回滴到第一二孔時(shí)將發(fā)生凝集，在后面兩孔將出現(xiàn)流淌現(xiàn)象；如果HA效價(jià)判定出現(xiàn)偏差，4HAU抗原檢測(cè)時(shí)濃度將出現(xiàn)偏高或者偏低。當(dāng)4HAU抗原濃度偏低時(shí)候需要添加抗原，當(dāng)4HAU抗原濃度偏高時(shí)需要補(bǔ)充一定的PBS

2.2 HI試驗(yàn)在HI試驗(yàn)時(shí)需要設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。操作過程中為了減少誤差，不論是在HA或HI實(shí)驗(yàn)中倍比稀釋時(shí)保持每次稀釋次數(shù)盡量一致（5～8次），稀釋時(shí)吸頭插入液面以下但不可過深，避免孔中液體產(chǎn)生氣沫，倍比稀釋后再加任何液體全部采用先加對(duì)照孔，其次按低濃度孔向高濃度孔順序添加，需要遵循“從后往前”加原則。加入抗原后在室溫（18～20℃）條件下靜置30min，再添加1%紅細(xì)胞懸液，在加抗原和紅細(xì)胞懸液時(shí)吸頭不要深入液面，盡量懸空垂直加樣。加入紅細(xì)胞后需要混勻（反應(yīng)板四邊輕輕手拍20次，嚴(yán)禁使用震蕩器混勻），避免紅細(xì)胞下沉。每次靜置時(shí)反應(yīng)板需封口，以免水分蒸發(fā)影響結(jié)果，孵育時(shí)間要嚴(yán)格控制。紅細(xì)胞對(duì)照完全沉淀時(shí)迅速判定，可將反應(yīng)板傾斜45°。判定最高稀釋度時(shí)需要結(jié)合紅細(xì)胞對(duì)照孔，與對(duì)照孔的流淌速度一致，淚滴大小一致的稀釋倍數(shù)孔為檢測(cè)樣品的最終效價(jià)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中要避免雜菌污染，因?yàn)槲廴舅斐傻姆橇鞲行缘哪匾部膳c所有抗原血清發(fā)生非特異性反應(yīng)。

2.3 結(jié)果判定試驗(yàn)結(jié)果將出現(xiàn)病毒對(duì)照孔完全凝集和稀釋液對(duì)照孔無凝集。

2.3.1 如果出現(xiàn)整板無紅細(xì)胞凝集（流淌）現(xiàn)象，首先考慮：a未加4單位抗原或4單位抗原配制過低。b 環(huán)境溫度過高或讀數(shù)時(shí)間拖延。

2.3.2 出現(xiàn)整板紅細(xì)胞凝集（不流淌）現(xiàn)象，原因有：a紅細(xì)胞、PBS液受污染或保存時(shí)間過長(zhǎng)。b 4HAU抗原配制失敗或滴加失誤。只有陰性對(duì)照孔血清滴度≦2log2，并且陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差±1個(gè)滴度的時(shí)候該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果才具有可參考性。測(cè)定孔血凝抑制試驗(yàn)效價(jià)以完全血凝抑制4HAU抗原血清的最高稀釋倍數(shù)為基數(shù)，將基數(shù)作為HI的滴讀。即紅細(xì)胞沉于孔底中心，呈紐扣狀，將板傾斜呈淚滴狀流淌。禽流感HI價(jià)≦2log2判定試驗(yàn)陰性，HI價(jià)等于3log2為可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)，HI價(jià)≥4log2為陽(yáng)性。

3 結(jié)束語

總之，為了確保禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)的精準(zhǔn)性，必須注重每個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)流程開展，做好試驗(yàn)環(huán)節(jié)質(zhì)量把控。最大限度降低試驗(yàn)誤差，為預(yù)防和控制禽流感得出精準(zhǔn)的意見。