二甲雙胍激活AMPK抑制特發性肺纖維化的研究進展

何遠芬，閔香玉，謝婷婷，楊信容，趙勇

遵義醫科大學附屬醫院，貴州遵義563000

特發性肺纖維化(IPF)是一種原因不明的，以彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂最終導致肺間質纖維化為特征的疾病，患者預后極差。目前，針對IPF的治療藥物較少，僅有的抗纖維化藥物還存在治療效果有限且不能延長患者壽命的缺點[1-3]。肺移植是唯一可延長IPF患者預期壽命的治療手段，但存在供體肺稀缺、術后并發癥多等不足[4]。因此，尋找安全有效且經濟實惠的治療藥物對IPF至關重要。磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)是一種重要的能量代謝激酶，能夠調控機體的能量代謝。有研究發現，IPF患者體內AMPK表達下調。因此，上調AMPK表達可能對IPF治療具有積極作用。二甲雙胍是國內外各大糖尿病指南推薦的2型糖尿病首選治療藥物，不僅能降低血糖，還能預防和減少糖尿病并發癥[5]。已有研究證實，二甲雙胍的降糖作用與AMPK信號途徑激活有關[6]。MANNING等[7]研究報道，在肺纖維化小鼠模型中，二甲雙胍可通過激活AMPK降低多種促纖維化蛋白表達，從而逆轉肺纖維化。二甲雙胍可能是目前發現的，唯一能夠逆轉肺纖維化的藥物。但由于目前還沒有動物模型能夠完全擬合人類IPF的病理變化，二甲雙胍在IPF臨床治療中的應用仍任重而道遠。本文結合文獻就二甲雙胍激活AMPK抑制IPF的研究進展作一綜述。

1 IPF概述

IPF是一種原因不明的慢性進行性纖維化性間質性肺炎，臨床特征是呼吸困難和肺功能逐漸惡化。IPF通常發生于中老年人，每年發病率為4/10萬～11/10萬，全世界已超過500萬例，其中位生存期僅3～5年[1-3]。糖皮質激素、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸可用于治療IPF，但并不能增加患者預期壽命，5年生存率仍低于50%。除此之外，長期使用皮質類固醇或類固醇激素還可引起多種不良反應，導致IPF患者病死率升高。尼達尼布和吡非尼酮雖然能阻止肺纖維化進程，但其價格昂貴、不良反應多且不能逆轉已經發生的肺纖維化。迄今為止，關于IPF的研究并不少見，但其確切病因和發病機制仍不完全清楚。持續性嚴重感染、放化療、環境暴露或不明原因所致的肺泡上皮細胞損傷，刺激各種免疫細胞浸潤肺組織并促進炎癥反應發生，引起上皮間質轉化(EMT)和多種纖維化相關因子分泌增加，肺成纖維細胞和肌成纖維細胞過度增殖并異常分化，表現為細胞外基質(ECM)蛋白過度沉積、代謝紊亂、線粒體功能障礙、自噬異常，繼而肺組織重塑和纖維化瘢痕形成并代替正常肺泡組織，肺功能呈進行性下降，最終因呼吸衰竭而死亡[3，8-9]。

2 二甲雙胍激活AMPK抑制IPF的機制

AMPK是由α、β、γ三種亞基組成的異源三聚體蛋白復合物，存在于所有真核細胞中。AMPK作為公認的細胞內能量感受器和代謝調節劑，不僅可控制合成代謝向分解代謝轉化，還能參與調控細胞的多種生物學過程，如自噬調節、內質網應激、氧化應激等。AMPK能夠刺激糖酵解、脂肪酸β氧化等能量生產途徑，抑制脂肪酸生物合成、膽固醇生物合成和糖異生等能量利用途徑。除此之外，AMPK激活還具有抗組織重塑功能。AMPK活性降低與肝、肺、腎等組織纖維化密切相關[3，10]。AMPK可在缺氧、葡萄糖缺乏等特定條件下被激活，其活性與細胞內AMP水平呈正相關關系。二甲雙胍是國內外各大糖尿病指南推薦的2型糖尿病首選治療藥物，能夠通過抑制呼吸電子傳遞鏈復合物Ⅰ，從而抑制線粒體氧化磷酸化，減少ATP生成并增加細胞質內AMP和ADP，進而提高AMP/ATP間接激活AMPK。二甲雙胍在IPF中的保護作用已有報道，其機制可能是通過激活AMPK實現的。目前認為，二甲雙胍激活AMPK可能通過以下途徑抑制IPF進展：阻斷核因子κB(NF-κB)通路，抑制炎癥反應；下調轉化生長因子β(TGF-β)表達，抑制肺纖維化；抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達，激活自噬[11-13]。

2.1 阻斷NF-κB通路，抑制炎癥反應 NF-κB是炎癥反應的主要轉錄因子，在免疫應答中起重要作用。NF-κB由Rel(c-Rel)、p65(RelA)、RelB、p50、p52五個亞基組成，其中p65是其主要亞基。二甲雙胍能夠阻斷NF-κB通路，抑制下游炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8表達。二甲雙胍通過激活AMPK抑制IκB激酶活性，抑制細胞因子誘導的NF-κB核易位，從而減弱了IκBα的磷酸化，抑制了IκBα降解。AMPK激活后，通過其下游介質沉默交配型信息調控2同源物1、叉頭盒蛋白O家族、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α和p53，間接抑制NF-κB信號傳導，從而抑制炎癥因子表達[13]。此外，內源性分子或微生物激活NF-κB可增加NLRP3炎癥小體表達。NLRP3炎癥小體是一種由NOD樣受體蛋白3、連接蛋白ASC和半胱天冬氨酸酶原1前體組成的多蛋白復合物。激活NLRP3炎癥小體可導致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1成熟及IL-1β、IL-8加工[14]。簡悅[15]研究表明，二甲雙胍能夠通過調節AMPK/NF-κB炎癥通路，改善肺纖維化大鼠肺部炎癥，對肺纖維化具有抑制作用。NF-κB在肺纖維化疾病的炎癥反應中具有重要作用，能夠引起一系列炎癥反應。而AMPK激活劑二甲雙胍可通過上調AMPK活性，抑制NF-κB表達，從而抑制炎癥因子釋放，在肺纖維化疾病的炎癥反應中發揮抑制作用。

2.2 下調TGF-β表達，抑制肺纖維化 TGF-β是已知最主要的促纖維化生成因子，在細胞或組織中廣泛表達。TGF-β與潛在的TGF-β結合蛋白形成復合體，以復合體形式被釋放出來，從而發揮一系列生物學功能。在IPF發生、發展過程中，TGF-β起著至關重要的作用。TGF-β能夠通過抑制上皮細胞增殖、促進肺泡上皮細胞異常修復和結構重塑介導肺纖維化[16]。TGF-β與靶細胞膜上的受體結合，以Smad依賴性和非依賴性方式調節靶基因轉錄，從而在炎癥細胞的活化、EMT和ECM生成等過程中發揮重要作用。在Smad家族中，Smad3充當致病性介質，而Smad2和Smad7作為保護性介質。TGF-β誘導的Ⅰ型膠原蛋白產生并伴隨著Smad3激活，誘導Smad3易位至細胞核，其作為轉錄激活因子上調上皮細胞中下游靶因子結締組織生長因子(CTGF)表達，進一步誘導Ⅰ型膠原蛋白生成。Smad3敲低則可抑制TGF-β對Smad3磷酸化和Ⅰ型膠原蛋白生成，降低CTGF表達[17]。在IPF動物模型和IPF患者肺組織中均發現TGF-β表達上調。肺泡上皮細胞受損時，活性氧簇分泌增多，基質金屬蛋白酶表達下調，Ⅳ型膠原蛋白降解，肺泡上皮細胞凋亡并阻礙正常上皮再生，活化的T細胞和巨噬細胞進入成纖維細胞，產生TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子，誘導EMT，促進成纖維細胞向成肌纖維細胞分化，導致包括纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原蛋白在內的ECM蛋白過度沉積，這一系列事件是由TGF-β通過經典的Smad2/3途徑或非經典的絲裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3激酶途徑引起的[11]。在博來霉素誘導的肺纖維化模型(BIPF)大鼠中，纖維化相關因子表達增加，二甲雙胍可通過抑制TGF-β1信號轉導，抑制肺泡EMT，上調肺組織上皮型標志物鈣黏蛋白、緊密連接蛋白1表達,下調α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、膠原蛋白表達和Smad2/3磷酸化水平[18]。AMPK激活可通過TGF-β抑制肌成纖維細胞增殖、分化，促進成纖維細胞死亡[3]。二甲雙胍激活AMPK通過抑制Smad3驅動的CTGF表達，降低TGF-β誘導的Ⅰ型膠原蛋白生成。TGF-β還可通過經典的Smad通路和非經典的Smad通路參與肺泡上皮細胞異常增殖和肺組織結構重塑，這也與AMPK活性受到抑制有關。二甲雙胍作為AMPK的激活劑可能通過上調AMPK活性，下調TGF-β表達，從而產生抗肺纖維化作用。

2.3 抑制mTOR表達，激活自噬 AMPK活性喪失會通過自噬不足、ECM累積和線粒體功能障礙，促進成纖維細胞持續活化[3]。AMPK/mTOR是主要的自噬通路，AMPK激活可通過直接磷酸化ULK1促進自噬，也可通過抑制mTOR激活自噬。自噬開始于吞噬體的分離膜吞噬細胞組分，受ULK1復合物、Beclin1復合物的激活控制；接著是吞噬體膜的延伸和融合形成自噬體，需要ATG5、ATG12和微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3(LC3)結合蛋白SQSTM1，并與自噬體內膜上的LC3-Ⅱ蛋白結合；隨后自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。Beclin1、ATG12、LC3-Ⅱ、p62等均被認為是自噬發生的生物標志物。Beclin1是自噬啟動的標志性蛋白。ATG基因通過ATG12-ATG5和LC3-Ⅱ復合體控制自噬體形成。LC3與自噬小泡的數量呈正比，是自噬小體的標志性分子。自噬受體蛋白p62是自噬后期的降解產物，與自噬活性呈負相關關系。磷酸化AMPK的主要上游激酶是肝激酶B1(LKB1)，下游底物蛋白是mTOR。LKB1可以編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，直接激活AMPK。二甲雙胍通過使LKB1蛋白表達和啟動子活性增加，以時間和劑量依賴方式刺激AMPK磷酸化而激活自噬，上調LC3-Ⅱ表達。3-甲基腺嘌呤和氯喹通過抑制自噬通路或下調Beclin1和LC3-Ⅱ，阻斷二甲雙胍的自噬保護作用[19-23]。在肺纖維化過程中，AMPK活性降低可激活mTOR表達，使自噬水平受到抑制，隨之發生纖維化病變。二甲雙胍通過激活AMPK/mTOR通路上調自噬水平而發揮抗肺纖維化作用。

3 二甲雙胍在肺纖維化模型中的應用

3.1 二甲雙胍在BIPF中的作用 BIPF是最經典的肺纖維化模型，被廣泛用于肺纖維化研究。在BIPF中，肺組織呈現明顯的纖維化病理改變，早期表現為肺部炎癥改變，晚期表現為肺部纖維化改變。有研究報道，二甲雙胍干預能夠降低BIPF小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)總細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞計數，血清炎癥因子(如TNF-α、IL-6)水平降低，肺組織勻漿纖維化標志物(如TGF-β、Smad2/3、Ⅰ型膠原蛋白等)表達亦降低[7，12，24]。GAMAD等[24]用不同劑量二甲雙胍干預BIPF小鼠，發現二甲雙胍能夠明顯改變肺纖維化病理改變，并具有劑量依賴性；進一步研究證實，二甲雙胍通過上調AMPK表達和活性，抑制TGF-β表達，從而發揮抗肺纖維化作用。結果表明二甲雙胍能夠降低BIPF小鼠肺部炎癥反應和纖維化程度[12，24]。

3.2 二甲雙胍在吉非替尼誘導肺纖維化中的作用 吉非替尼是一種治療肺癌的表皮生長因子受體—酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，其副作用之一是可導致肺部炎癥反應和纖維化。LI等[25]在雄性SD大鼠氣管內注射博來霉素可導致正常肺結構破壞，成纖維細胞和炎癥細胞增多，膠原纖維廣泛沉積；口服吉非替尼可顯著增強其肺纖維化程度；羥脯氨酸(HYP)是肺纖維化中膠原纖維的主要成分之一，二甲雙胍干預后可使肺組織HYP表達降低。二甲雙胍能夠顯著降低EGFR-TKI治療后肺癌細胞中TGF-β表達，其下游分子IL-6、pSmad2和pSmad3表達降低，減少了肺泡區EMT發生。以上研究表明，二甲雙胍能夠用于治療吉非替尼誘導的肺纖維化，或許今后可以與抗腫瘤藥物一起服用，來預防吉非替尼副作用引起的肺纖維化。

3.3 二甲雙胍在輻射誘導肺纖維化中的作用 放療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，但輻射過量可誘導肺纖維化。WANG等[26]研究發現，SD大鼠接受全肺20 Gy照射后肺密度值明顯升高，而二甲雙胍干預后能明顯降低胸部照射引起的肺密度值升高，說明二甲雙胍能夠降低肺實質組織病理學改變，局灶性纖維化結節、炎癥浸潤和膠原沉積明顯改善；二甲雙胍治療后肺組織HYP、Col1、TGF-β表達降低，還觀察到二甲雙胍干預能夠抑制輻射誘導的pSmad2、pSmad3表達。以上研究表明，二甲雙胍能夠抑制輻射誘導的肺纖維化，其機制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路，從而減弱輻射誘導的肺成纖維細胞活化有關。因此，二甲雙胍可能適用于放療引起肺纖維化的預防和治療。

當前，對IPF仍缺乏有效的治療手段，二甲雙胍作為治療2型糖尿病的首選藥物，能夠通過激活AMPK作用于下游靶標NF-κB、TGF-β、mTOR，從而通過抑制炎癥反應、肺纖維化和激活自噬發揮肺保護作用。二甲雙胍對IPF動物模型具有較好的肺保護作用，但對IPF患者并未明顯改善疾病進展和臨床預后[27]，這可能與評價標準不一、觀察時間不足以及服用可能影響結局的干預藥物等有關。二甲雙胍雖然有望成為未來治療IPF相對理想的藥物，但目前仍需要相關的臨床研究進一步探索。