多重核酸即時檢驗在新型冠狀病毒肺炎診斷及鑒別診斷中的價值

劉 杰 曲 芬 戚麗華 任昊遠(yuǎn)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)屬于國家“乙類”傳染病，采取“甲類”傳染病防控措施[1-3]。感染主要為飛沫和近距離接觸傳播，可經(jīng)人與人傳播，人群普遍易感，且重癥病例病亡率高[4-6]。有研究表明，COVID-19有可能轉(zhuǎn)成慢性的、像流感一樣長期在人間存在，潛在的風(fēng)險可能是長期且巨大的，對此發(fā)熱門診應(yīng)常態(tài)化，成為一項醫(yī)院的標(biāo)準(zhǔn)流程[7-8]。因此，醫(yī)院如何立足于在發(fā)熱門診建立快速診斷能力的建設(shè)非常重要。通過綜述多重核酸即時檢驗(point-ofcare test，POCT)對國際病毒分類委員會命名的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的快速診斷及鑒別診斷的價值，為有效防控COVID-19疫情提供參考。

1 呼吸道病毒所致疾病的診斷與鑒別診斷

SARS-CoV-2屬于β屬的冠狀病毒，其基因特征與SARSr-CoV和MERSr-CoV有明顯區(qū)別[2]。世界衛(wèi)生組織將SARS-CoV-2感染引起的疾病正式命名為“COVID-19”。流行病學(xué)調(diào)查[9]顯示，COVID-19大多數(shù)為輕癥病例，但具有高度傳染性，潛伏期多為1～14 d，病死率約為2%[10-11]。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[2]中指出，COVID-19確診病例須病原學(xué)檢測呈陽性，即實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性；或病毒基因測序與已知2019-nCoV高度同源。COVID-19感染輕型表現(xiàn)需與其他病毒引起的上呼吸道感染相鑒別，尤其是對疑似病例要盡可能采取包括快速抗原檢測和多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)核酸檢測等方法，對常見呼吸道病原體進行檢測[2]。

造成呼吸道感染的病原體主要是各種呼吸道病毒，以及細(xì)菌、支原體、衣原體、真菌及寄生蟲等[12]。近年來，一些呼吸道病毒如甲型流感病毒、腺病毒以及不斷變異的SARS-CoV-2所導(dǎo)致爆發(fā)的疫情，成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的重要問題

2 呼吸道感染病原體的檢測現(xiàn)狀

呼吸道病原體的檢測方法主要有病原體培養(yǎng)法、膠體金篩查流感抗原、免疫血清學(xué)檢測抗體以及實時熒光定量PCR檢測核酸。抗原初篩檢測盡管快速，但其敏感性低且不能區(qū)分亞型；血清學(xué)方法只能檢測免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，且耗時較長；核酸檢測方法敏感性高，特異性強，可以區(qū)分亞型，但需要專業(yè)的實驗室和昂貴的儀器設(shè)備，操作復(fù)雜，對檢驗人員的資質(zhì)要求較高，不能滿足基層單位篩查防控的需求。

2.1 呼吸道感染病原體抗體檢測

針對COVID-19的疫情，許多高新企業(yè)已成功研發(fā)了SARS-CoV-2的IgM抗體檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)以及SARS-CoV-2的IgM抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)2種檢測方法學(xué)的產(chǎn)品[13]。膠體金免疫層析法檢測試劑的特點為：15 min出結(jié)果，無需儀器，適合現(xiàn)場快速篩查。

呼吸道病原體九聯(lián)檢[14]采用九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑(間接免疫熒光法)，同時檢測甲型流感病毒(influenza A virus，INFA)，乙型流感病毒(influenza B virus，INFB)，副流感病毒1型、2型及3型(parainfluenza virus type1，2，3 PIV)，嗜肺軍團菌(legionella pneumophila，LP)，肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)，Q熱立克次體(Q rickettsia，QFB)，肺炎衣原體(chlamydia pneumoniae，CPn)，腺病毒(adenovirus，ADV)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)等9項病原體的IgM抗體。呼吸道病原九聯(lián)檢的檢測方法在呼吸道感染檢測中檢出的陽性率高，能夠同時檢測9種病原體，可及時發(fā)現(xiàn)感染的病原體，為臨床呼吸道感染疾病的診斷及鑒別診斷提供一定的支持依據(jù)。

2.2 單一呼吸道病原體擴增和檢測

2.2.1 甲型流感病毒快速基因分型POCT方法

ParaDNA核酸POCT檢測儀及其配套的HyBeacon熒光探針檢測技術(shù)，是當(dāng)前POCT分子診斷的前沿代表[15]。該方法建立一種基于Beacon-ParaDNA技術(shù)平臺對甲型流感病毒進行快速基因分型的方法，由于具有準(zhǔn)確度和靈敏度高、設(shè)計靈活、兼容性好、無交叉污染及支持現(xiàn)場快速檢測等特點，已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定、病原微生物檢測、食品衛(wèi)生安全以及藥物基因組學(xué)等領(lǐng)域。

2.2.2 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的CRISPR-nCoV試劑盒

2018年，Science封面文章表明，基因編輯工具CRISPR-Cas系統(tǒng)用于病原檢測，可實現(xiàn)2 h內(nèi)鑒定區(qū)分人體樣本中的寨卡、登革熱、黃熱病毒和西尼羅河病毒。2019年9月，微遠(yuǎn)基因與華山醫(yī)院感染科合作，快速超敏結(jié)核分枝桿菌診斷方法CRISPRMTB發(fā)表[16]。COVID-19疫情期間，微遠(yuǎn)基因利用自有CRISPR病原診斷平臺，基于GISAID公布的SARS-CoV-2序列(BetaCoV/Wuhan/IPBCAMSWH-01/2019，Collection date：2019-12-24)，設(shè)計特定CRISPR檢測位點，開發(fā)出超高敏CRISPRnCoV檢測試劑盒。CRISPR-nCoV試劑盒靈敏度可低至單個拷貝，具備與其他冠狀病毒明確區(qū)分的高特異性，可檢測痰液、拭子、肺泡灌洗液等多種樣本類型，用樣量可以低至100 μl，實現(xiàn)了高特異性、單拷貝級別靈敏度以及40 min快速的SARS-CoV-2核酸檢測，并且檢測儀器便攜可拓展，具有實現(xiàn)床旁POCT的應(yīng)用潛力。

2.2.3 等溫擴增技術(shù)在呼吸道病原體的應(yīng)用

等溫擴增技術(shù)與傳統(tǒng)PCR相比，儀器簡單、擴增時間短，還保持了高靈敏性及特異性，適合快速檢測，在結(jié)核分枝桿菌等病原體檢測中被廣泛應(yīng)用[17]。等溫擴增技術(shù)的反應(yīng)原理不同，分為環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴核酸序列型擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、鏈置換擴增(strand displacement amplification，SDA)、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)、單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification，SPIA)、交叉引物等溫擴增(cross priming amplification，CPA)以及新型等溫多自配引發(fā)擴增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification，IMSA)等技術(shù)。但等溫擴增技術(shù)也具有對引物設(shè)計要求高、不能擴增較長目的片段及易產(chǎn)生假陽性等局限性，因此，此方法在SARS-CoV-2的檢測中能否克服上述缺陷，達(dá)到快速精準(zhǔn)檢測的目的，仍有待于臨床進一步應(yīng)用評估。

2.2.4 Alere i的COVID-19分子即時檢測POCT產(chǎn)品

Alere i檢測測試盒是采用恒溫核酸擴增技術(shù)-切口延伸擴增技術(shù)(nicking enzyme amplification reaction，NEAR)來檢測病毒核酸，使用特定捕獲酶來驅(qū)動擴增反應(yīng)，該試劑一般包括有切口酶、前向模板核酸及反向模塊核酸和聚合酶等，其操作方法為：①將待測樣品加入到離心管A中；②用移液槍取一定體積待測樣品加入到離心管B中，該離心管中有反應(yīng)所需的各種試劑；③將離心管B放入檢測儀器中進行反應(yīng)，如PCR擴增儀等，反應(yīng)一段時間后通過儀器檢測得出結(jié)果。檢測在5 min內(nèi)即可給出陽性結(jié)果，13 min內(nèi)給出陰性結(jié)果，是目前速度最快的即時檢測之一。該測試基于雅培的Abbott ID NOW診斷平臺。ID NOW?是一種快速、基于儀器的恒溫擴增檢測系統(tǒng)，用于感染性疾病的定性檢測，將在醫(yī)生辦公室、緊急護理診所和醫(yī)院急診科等廣泛的醫(yī)療保健環(huán)境中提供快速的結(jié)果。ID NOW于2014年首次推出，是甲型和乙型流感、甲型鏈球菌和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的分子床旁檢測平臺[18]。SARS-CoV-2試劑是新開發(fā)的產(chǎn)品，其Alere i檢測儀器和測試盒見圖1。

圖1 Alere i檢測儀器和測試盒

3 多重核酸POCT在呼吸道病原體檢測中的研究進展

由于可引發(fā)呼吸道感染的病原體種類繁多，患者可能攜帶不止一種病原體，不同病毒之間以及病毒和細(xì)菌之間的臨床體征和癥狀相互重疊，往往使得僅基于臨床表現(xiàn)的病因診斷變得困難，無法確定致病原因，導(dǎo)致經(jīng)常規(guī)治療無效，造成抗生素濫用以及醫(yī)源性交叉感染，因此鑒別診斷COVID-19中最常見的病原體，如流感病毒，便于及時隔離不同型別和亞型的流感患者，對防止病毒的傳播意義重大。在排除樣本質(zhì)量、樣本收集時機以及污染和技術(shù)問題的情況下，從咽拭子或其他呼吸道樣本中，多次、多種標(biāo)本和使用多種熒光定量PCR檢測試劑盒，檢查出SARSCoV-2的RNA陽性，對病原學(xué)診斷有重要支持意義。但是如何能快速準(zhǔn)確、高通量檢測出患者所感染的呼吸道病原體，一直是臨床診斷面臨的難點。

3.1 核酸POCT技術(shù)

核酸POCT技術(shù)[19]是現(xiàn)場使用便攜式核酸儀器及配套試劑，該儀器將核酸擴增、信號收集與結(jié)果分析功能整合，能夠快速完成檢測，并能有效防止交叉污染。目前，國內(nèi)已有多家企業(yè)宣布研發(fā)出全自動核酸擴增檢測分析儀及配套試劑盒，其操作簡便，結(jié)果快速、準(zhǔn)確，這對基層開展快速篩查具有重要意義，并緩解疫情患者診斷及鑒別診斷的壓力。隨著免疫層析技術(shù)、微流控芯片技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)核酸POCT產(chǎn)品的不斷研發(fā)及應(yīng)用，能夠?qū)Ξ?dāng)前檢測形成有效補充。

3.2 多重核酸POCT進展

圖2 核酸檢測試紙原理

多重核酸擴增檢測[20]是一種速度快、靈敏度高且特異性強的檢測方法，能提供多目標(biāo)產(chǎn)物的共擴增，從而對呼吸道疾病混合感染的預(yù)后和復(fù)發(fā)提供重要信息。多重核酸擴增可以顯著減少檢測操作時間和成本，并且能夠快速得到結(jié)果。博奧生物集團應(yīng)用恒溫擴增和微流控碟式芯片相結(jié)合的技術(shù)，對13種常見下呼吸道病原體靶基因進行擴增和檢測，可為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據(jù)，且能提供多目標(biāo)產(chǎn)物的共擴增，從而對呼吸道疾病混合感染的預(yù)后和復(fù)發(fā)提供重要信息。

3.3 RNA恒溫擴增-金探針層析法

RNA恒溫擴增-金探針層析法[21]是新一代的核酸檢測技術(shù)，通過膠體金條帶判讀結(jié)果的方法，對SARS-CoV-2和甲型、乙型流感病毒核酸及其他呼吸道病毒進行快速定性檢測，對臨床上確診SARSCoV-2有重要意義，其特點是以病原體的RNA為靶標(biāo)核酸，在逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶的作用下，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄過程，實現(xiàn)RNA核酸片段的擴增。然后采用金探針層析法，將RNA擴增產(chǎn)物-特異探針-金標(biāo)探針復(fù)合物在NC膜上固定形成條帶，結(jié)果判讀一目了然。該方法可以將膠體金免疫層析技術(shù)的操作簡單、快速且價格低廉等特點應(yīng)用到核酸的多重檢測中來，實現(xiàn)甲型、乙型流感病毒核酸+SARS-CoV-2核酸的膠體金標(biāo)核酸POCT診斷試劑的開發(fā)，其原理是在核酸檢測試紙條上，將通用探針標(biāo)記上膠體金顆粒后，固定于玻璃纖維素膜上，檢測病原體核酸時，設(shè)計兩套特異探針，即特異探針A和特異探針B。兩套探針的使用使得其中任何一套探針和病原體核酸擴增片段雜交失敗，都不能夠形成被試紙條檢出的復(fù)合物，也就出現(xiàn)不了陽性檢測結(jié)果，保證了檢測的特異性。只要設(shè)計針對不同病原體核酸的特異探針即可完成同一張試紙條多種核酸的檢測，可以大幅降低檢測成本。核酸檢測試紙原理見圖2。

該方法無需核酸提取，無需專業(yè)實驗室，無需生物安全柜和熒光PCR儀就可進行實驗，僅需直接將患者鼻咽拭子標(biāo)本加入儀器，即可快速而準(zhǔn)確地檢測出SARS-CoV-2和各種流感病毒，應(yīng)用在門診或急診，患者可以快速獲得檢驗報告，推薦向基層和偏遠(yuǎn)地區(qū)的醫(yī)療機構(gòu)普及，尤其適合于發(fā)熱門診內(nèi)的快速篩查2019-nCoV之用。

4 核酸POCT在疫情中的應(yīng)用

在疫情防控工作中，方艙醫(yī)院發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[22]。在方艙醫(yī)院經(jīng)過實踐檢驗之后，將拓展到更多的使用場景。為此，需要將核酸檢測POCT化，配置到方艙醫(yī)院中，同時多重核酸POCT成為發(fā)熱門診的標(biāo)配。對于當(dāng)下POCT的局勢，檢測項目的選擇要比平臺的建立更為重要，因此可用于鑒別診斷COVID-19與常見呼吸道病原體的多重呼吸道病原學(xué)核酸檢測，包括臨床常見呼吸道病毒和支原體及衣原體感染的檢測，涵蓋腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、支原體、衣原體、甲型和乙型流感病毒及SARS-CoV-2核酸，以及鑒別診斷SARS和SARSCoV-2的雙項目檢測系統(tǒng)，可能為核酸POCT的終極方向。

SARS-CoV-2核酸檢測在COVID-19的診斷、療效監(jiān)測及疫情防控中發(fā)揮了重要作用，而多重核酸POCT技術(shù)在呼吸道病毒檢測中的意義更加重要。作為一種包括SARS-CoV-2核酸試紙條檢測技術(shù)，成功的融合了膠體金快速的特點。通過試紙條檢測核酸，只需10 min左右即可進行結(jié)果判讀，在操作上也十分簡單，只需將核酸特異擴增物和檢測探針混合后滴到檢測試紙上即可，對實驗人員技術(shù)要求低，更無需特殊的儀器設(shè)備，易于核酸檢測向基層及偏遠(yuǎn)農(nóng)村醫(yī)療機構(gòu)的推廣。

5 展望

對呼吸道病原體的快速檢測是對抗疫情的強有力工具。如韓國的“得來速”檢測法，“免下車”病毒檢測方式更安全、更迅速[23]。同時也減少了一線醫(yī)務(wù)工作人員接觸病毒的機會，患者對公共衛(wèi)生設(shè)施的污染也較小。而應(yīng)用POCT檢測SARS-CoV-2，操作簡便，結(jié)果迅速，適合現(xiàn)場檢測操作，也是認(rèn)真貫徹落實“外防輸入、內(nèi)防反彈”防控策略，及早發(fā)現(xiàn)和控制COVID-19傳染源，同時滿足有關(guān)單位和個人多樣化的檢測需求的措施和手段。目前COVID-19傳染的起源、發(fā)病的疾病譜及發(fā)病機制，仍有待于進一步研究發(fā)現(xiàn)，相信多重核酸POCT將為抗擊疫情做出巨大的貢獻(xiàn)。