葡萄糖氧化酶協同抗生素抑菌效果的研究

◆作者：荊新堂 于東 陳寧波 芮法祥 杜正超

促生長抗生素（AGP）是一類對致病菌、寄生蟲等具有抑制和殺滅作用的藥物添加劑，被廣泛應用于飼料生產和養殖業中，在提高飼料轉化率、促進畜禽生長方面發揮了重要的作用。在實際生產中，由于AGP的長期使用，養殖環境中致病菌的耐藥性不斷增強，各種混合感染導致的動物病死率逐年上升，給養殖戶造成了極大的經濟損失。由于常規治療用抗生素使用量越來越大，食品中抗生素殘留出現的概率越來越高，尋找AGP的替代品成為畜牧行業關注的焦點，低抗或無抗養殖成為當前畜牧業發展的一大趨勢。

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOX）是一種以FAD為輔基的黃素蛋白酶（圖1），能夠利用分子氧作為電子受體，催化β-D-葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸和過氧化氫（圖2）。作為一種綠色安全的添加劑，在化工、制藥、食品、飲料、臨床化學、生物技術等行業得到廣泛應用。而在飼料添加劑領域，葡萄糖氧化酶以其無毒、無耐藥性、無殘留的特點，成為近幾年來繼酸化劑、益生菌、植物提取物等之后的又一研究熱點。

圖1 葡萄糖氧化酶帶狀分子結構

圖2 葡萄糖氧化酶的作用機理

當前，葡萄糖氧化酶的研究報道主要集中于酶活檢測和養殖端的應用效果驗證上，對聯合抗生素進行抑菌、減少抗生素的使用方面的研究較少，本試驗從體外抑菌的角度，研究葡萄糖氧化酶、抗生素、葡萄糖三種組分在何種濃度下，對致病菌的抑制效果最好，以期為葡萄糖氧化酶在養殖生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水溶性葡萄糖氧化酶：酶活1000 U/g，濟南百斯杰生物工程有限公司；大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，廣東環凱微生物科技有限公司；替米考星、硫酸粘桿菌素、安普霉素、痢菌凈，濟南禽牧幫生物技術有限公司。

1.2 試驗設計

本試驗采用牛津杯法（管碟法）對致病菌進行抑菌圈的測定，采用液體培養鑒定OD600值的方法對致病菌進行抑菌率的測定。

1.2.1 試驗一：GOX對致病菌的抑制試驗

配制濃度分別為200mg/L、300 mg/L、600mg/L的GOX溶液（含1%葡萄糖）待用。采用雙層平板進行致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）菌液的涂布，即在無菌培養皿中倒入15 mL LB瓊脂培養基封底，凝固后取0.4 mL濃度為108 CFU/mL菌液加入到100 mL LB瓊脂培養基（55～60℃）中混勻，后取6 mL加入到LB平板中。待平板凝固后，在培養基表面放置一個牛津杯，分別加入200μL的GOX溶液，37℃培養24 h，測定抑菌圈大小。

1.2.2 試驗二：抗生素+GOX在LB瓊脂培養基中的抑菌試驗（測抑菌圈）

配制100 mg/L的抗生素（替米考星、硫酸粘桿菌素、安普霉素、痢菌凈）水溶液（含1%葡萄糖），分對照組和試驗組。對照組加蒸餾水，試驗組加GOX，分別制成試驗樣液待用。采用雙層平板進行致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）液的涂布（操作同試驗一），待平板凝固后，在培養基表面放置一個牛津杯，分別加入200μL的試驗樣液，37℃培養24 h，測定抑菌圈大小。

1.2.3 試驗三：抗生素+GOX在LB液體培養基中的抑菌試驗（測OD600值）

將菌液（金黃色葡萄球菌）稀釋到106CFU/mL待用。試驗分對照組和試驗組1、2、3，取離心管分別加入菌液、抗生素（100 ppm替米考星）、GOX、葡萄糖（見表1），其中試驗組1、2、3中的GOX又分為9個濃度梯度（0.1 U/mL～0.9 U/mL），再加入LB液體培養基，最后將每個管內溶液的體積用蒸餾水補至相同。37℃，200 rpm恒溫搖床培養，24 h后測溶液的OD600值，計算抑菌率。

抑菌率（%）=（陽性對照-試驗）/（陽性對照-陰性對照）×100

1.2.4 試驗四：抗生素+GOX抑菌試驗中GOX和葡萄糖添加量的優化試驗

首先配制濃度為100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L的GOX溶液，再將每個濃度的GOX溶液中分別添加1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.1%、0.0625%的葡萄糖溶液，最后在每個溶液中添加一定量的抗生素（替米考星），使抗生素的終濃度為100mg/L，進行致病菌（大腸桿菌）的培養，37℃，200 rpm恒溫搖床培養，24 h后測溶液的OD值，計算抑菌率。

2 結果

2.1 GOX對致病菌的抑制試驗

在溶液中有葡萄糖存在的情況下，添加不同劑量的GOX，均可以抑制致病菌的生長。對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種致病菌的作用結果相同，即GOX的濃度越高，抑菌圈的直徑呈現出越大的趨勢（表2）。

表2 不同劑量GOX對腸道致病菌的抑菌效果

2.2 抗生素+GOX在LB瓊脂培養基中的抑菌試驗

抑制金黃色葡萄球菌的試驗：與對照組相比，抗生素為替米考星時，抑菌圈面積提高23%；抗生素為硫酸粘桿菌素時，抑菌圈面積提高40%；抑制大腸桿菌的試驗：與對照組相比，抗生素為安普霉素時，抑菌圈面積提高32%；抗生素為痢菌凈時，抑菌圈面積提高27%（表3）。

表3 GOX對抗生素的協抗作用

2.3 抗生素+GOX在LB液體培養基中的抑菌試驗

在同一試驗組中，GOX濃度介于0.1～0.9 U/mL時，各個試驗組抑菌效果相差不大，基本維持在97%～98%；在不同的試驗組中，與對照組相比，各試驗組在添加GOX之后，均體現出較好的抑菌效果，抑菌率比對照組提高了6.5%～8.0%，其中，以GOX+葡萄糖+替米考星的組合抑菌效果最好（圖3）。

2.4 抗生素+GOX抑菌試驗中GOX和葡萄糖添加量的優化試驗

在抗生素（100mg/L替米考星）固定的條件下，隨著葡萄糖添加量的降低，GOX+抗生素抑菌效果有所下降，但降幅較小，從優化試驗的角度考慮，當葡萄糖添加量為0.1%時，GOX仍然能夠發揮良好的抑菌效果。

隨著GOX濃度的降低，協抗抑菌作用有所下降，但降幅較小。當GOX的濃度最小為50 mg/L時，仍有比較明顯的協抗抑菌效果（圖4）。

3 討論

3.1 GOX對致病菌的抑制作用

GOX是一種比較特殊的酶制劑，它不同于我們理解中的消化酶、非淀粉多糖酶。它的作用機理是通過葡萄糖的氧化消耗氧氣，同時產生葡萄糖酸和過氧化氫。腸道中氧氣減少，創造有利于有益微生物生長繁殖的無氧條件；過氧化氫雖不穩定，但抗微生物起作用的濃度極低。有試驗表明，大腸桿菌培養時給予恒定濃度的過氧化氫（濃度0.02～0.05 mmol/L）時，大腸桿菌生長即受抑制，該濃度不傷害人皮膚的成纖細胞，也遠遠低于現行過氧化氫消毒液。本試驗中單獨添加GOX即能產生良好的抑菌效果，是由于GOX催化反應過程中產生過氧化氫，而且過氧化氫不斷累積所致。GOX濃度越大，累積的過氧化氫越多，抑制效果越好，這與湯海鷗等（2015）的研究結果相一致。而在動物腸道中，過氧化氫不會產生累積效果，更多的是從改善腸道微生物生長環境入手，不會使致病菌產生耐藥性，不會產生殘留，更不會對動物產生副作用，是名副其實的綠色安全健康產品。

圖3 不同試驗組的抑菌率對比

圖4 不同濃度葡萄糖及GOX的抑菌率對比

3.2 抗生素+GOX聯合使用對致病菌的抑制作用

由于飼用促生長抗生素的長期使用，養殖環境中致病菌的耐藥性越來越強，治療用抗生素的使用效果越來越差，尋找一種抗生素的替代物或增強劑來緩解致病菌耐藥性的問題迫在眉睫。試驗二和試驗三從固態和液態兩個角度分別進行抑菌圈和OD值的測定，試驗所用致病菌包括金黃色葡萄糖菌（G+）和大腸桿菌（G-）兩種；所用的抗生素既有飼料禁抗前長期在飼料中使用的硫酸粘桿菌素，又有養殖終端常用的替米考星、痢菌凈、安普霉素，整個試驗涉及范圍廣，代表性強，全面驗證了GOX在各種條件下的作用效果。GOX既可以作為一種抗生素抑菌增強劑，也可以單獨長期使用，從不同的方位和角度維持動物腸道健康，從而達到替抗、減抗、無抗的目的，是一種綠色、環保、無殘留、無害的飼料添加劑。

3.3 GOX和葡萄糖添加量的優化試驗

作為一種特殊的功能性添加劑，GOX作用的發揮依賴于葡萄糖的存在，葡萄糖添加量的大小直接影響到GOX抑菌功能的發揮。由于腸道是淀粉消化的主要場所，葡萄糖的含量較高，GOX與飼料一同飼喂動物，可不考慮腸道中葡萄糖含量不足的問題。但在體外試驗中，葡萄糖的多少對于試驗的成敗至關重要。試驗三中的試驗組1（替米考星+GOX）雖然未加葡萄糖，與對照組相比，抑菌率達到97%以上，是由于抗生素載體中含有部分葡萄糖（掩蓋替米考星的苦味）所致。本試驗通過對GOX和葡萄糖添加量的優化，既驗證了葡萄糖在GOX協抗作用中的重要性，也驗證了GOX協抗抑菌的最小添加量，為GOX在實際生產中進行應用提供了指導。

4 結論

GOX對不同致病菌均有抑制作用，添加量越高，抑菌效果越好。

GOX作為一種抑菌增強劑，可以提高抗生素的抑菌效果，減少抗生素的使用量。

參考文獻：（略）