基于中藥血清藥理學與血清藥物化學的中藥藥效物質基礎的研究進展

崔素華，梁 楓，張 瑞，黃維琳

（安徽中醫藥高等專科學校，安徽 蕪湖 241000）

1984年，日本學者Hiroko Iwama在對漢方藥的研究過程中首次提出“血清藥理學”和“血清藥物化學”這兩個重要概念，對藥物物質基礎研究的系統化和規范化具有里程碑式的意義。由于中藥及中藥復方成分復雜，若直接加入體外反應體系，其實驗結果會與體內作用機制有所不同，且藥物必須經過血液循環才能起作用（腸道直接起作用及外用藥除外）。因此，我國學者提出了“中藥血清藥理學”和“中藥血清藥物化學”這兩個概念，目的是為了探明中藥入血起效的成分。血清藥理學和血清藥物化學是兩個不同的研究領域，但它們之間又密切相關。在含藥血清中，藥物的化學成分與其藥理效應是緊密相關的。因此，研究藥物化學成分的本質及其藥理效應，對促進藥物藥效物質基礎研究的發展具有重要意義[1]。目前，國內學者逐漸將血清藥理學和血清藥物化學的研究運用到中藥藥效物質基礎研究體系。研究中藥藥效的化學成分以及明確不同成分的藥理效應，是關系到中藥臨床應用安全的關鍵因素，也是制約中藥現代化及國際化發展的關鍵問題[2]。血清藥理學和血清藥物化學概念的提出與完善，以及化學分析手段的進步，有助于推動中藥現代化研究的進一步發展。

1 中藥血清藥理學研究進展

中藥血清藥理學的研究方法與傳統藥物體外研究有所不同，它是指中藥或中藥復方在動物體內吸收及作用一定時間后，采集、分離動物血清，將含藥血清作為藥物直接加入體外反應體系，用體外模型進行藥效評價的方法。通過模擬藥物在體內的吸收和代謝反應過程，研究其藥效及作用機制，既能減少中藥粗制劑對體外實驗產生的干擾，又符合中藥經機體消化吸收、生物代謝后產生藥理效應的生理過程[3]。

1.1 含藥血清的制備

1.1.1 動物選擇 邢作英等[4]認為在實驗動物的選擇上應注重制備血清的動物與實驗所用離體器官、組織、細胞種屬保持一致。血清成分十分復雜，不同種屬的血清成分可能因在理化、生物等方面的差異以及免疫排斥反應，對實驗結果產生影響，因此，選擇合適的動物模型以及相應的體外反應體系，能更準確地反映藥物在機體內的生物過程與藥物效應。目前，含藥血清主要來源于大鼠、豚鼠、家兔等。張聲鵬等[5]報道在生理或病理狀態下，機體對藥物作用的反應不同，分離出的含藥血清成分及含量也有所差異。因此，含藥血清的制備不僅要選擇合適的動物模型，還要考慮生理狀態的影響。

1.1.2 給藥、取血方案 實驗動物的給藥途徑多樣，其中灌胃給藥是常見給藥途徑，其對機體傷害小，操作簡單，被廣泛運用。張宏等[6]在研究中提出使用以下公式作為灌胃給藥量參考：每日給藥量＝成人日用量/成人標準體質量×人與動物等效劑量換算倍數/培養基中含藥血清濃度。實踐過程中，最常用的是以臨床等效關系為參考，通過預實驗摸索最佳給藥劑量。李儀奎等[7]提出以每天給藥兩次，連續給藥3天，末次給藥一小時后采血制備含藥血清的通用實驗方案，但也有學者提出采血時間不必局限于傳統方法，可根據具體情況而定。含藥血清的采集可以選擇大鼠股動脈或下腔靜脈采血法、家兔耳緣靜脈或頸動脈采血法等[8]。

1.2 含藥血清的處理及保存

血清成分復雜，含有多種微量活性物質，包括酶、抗體、補體、細胞因子等，這些活性物質在進入體外反應體系后，對結果造成的影響往往難以評估，因此在加入前，應將含藥血清滅活，有助于減少非藥理性的干擾，也符合防止微生物感染的細胞培養要求[9]。國內學者用得比較多的是水浴滅活法。但也有學者認為分離的含藥血清可以不滅活處理，因為通過設立空白對照組血清，可以比較含藥血清中藥物的藥理學效應[10]。血清的保存對實驗結果同樣會有影響，國內研究者依據實驗時間，一般采用-20℃的短期保存和-80℃長期凍存。

1.3 中藥血清藥理學方法學研究

藥理學研究理念和方法的不斷完善是規范化、標準化中藥血清藥理研究的基礎。近年來，中藥血清藥理學方法成為中藥規范化、標準化研究的主要方法之一。魏元鋒等[11]在研究過程中提出，通過使用現代分析技術，包括液相色譜法、液相色譜-質譜聯用、超高效液相色譜-質譜聯用、氣相色譜-質譜聯用等手段，分離、鑒定含藥血清中的不同成分，建立血藥成分的量效關系，是中藥血清藥理學藥效物質研究的基礎。含藥血清實驗方法的建立具有重要的臨床意義，其不僅有助于進一步發現藥物的有效成分或有效部位，還可以為制備藥效明確的中藥制劑以及提高臨床療效和降低毒副作用提供更貼近實際的參考[12]。近年來，我國學者在中藥含藥血清藥理研究方面取得了一定進展，并對研究方法進行了較為系統的改進[13]。

2 中藥血清藥物化學研究進展

中藥物質成分的分離和鑒定是中藥藥效物質基礎研究的重點。血清藥物化學的提出，是對中藥藥效物質基礎研究的重要補充。血清藥物化學的研究是以從動物體內分離的含藥血清為樣品，以現代化的化學分析手段為基礎，綜合分析、鑒定含藥血清中的入血成分與代謝產物，發現中藥入血后的有效物質成分，以及不同成分、代謝產物的藥物代謝動力學特點[14]。將血清藥物化學運用于中藥物質基礎研究，可以彌補血清藥理學難以鑒定有效作用物質成分、排除血清固有成分干擾、測定藥物動態代謝的缺陷。中藥血清藥理學與血清藥物化學協同研究，推動中藥研究向國際精準化研究標準發展[15]。目前，中藥血清藥物化學主要通過超高效液相色譜等現代化學分析手段，對比分析含藥血清與對照血清色譜指紋圖譜的差異，從而鑒定含藥血清中的原有成分、代謝產物或血清內源性物質。

2.1 單味中藥的血清藥物化學研究

由于中藥成分復雜，不同化學成分有多種藥理作用，即使是單味中藥也含有復雜的化學成分。因此，明確藥物的化學成分是至關重要的。吳賢波等[16]采用液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）明確了烏梅藥材原型入血的成分有3種（齊墩果酸、熊果酸、苜蓿酸），入血后的代謝產物有10種。付燕偉等[17]采用液相色譜法（HPLC）技術明確了桑白皮的大鼠含藥血漿中有7個移行成分，鑒定入血原型成分桑皮苷A。李靜靜等[18]采用液相色譜法（HPLC）技術明確了川芎提取液灌胃后血中有7個入血成分，其中4個為代謝產物，3個為原型成分，川芎入血成分主要為川芎嗪和阿魏酸。梁華等[19]采用液相-固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜聯用技術（UPLC-MS/MS）明確了用五味子提取物給大鼠模型灌胃后，其血清中所含主要原型成分為五味子醇甲、醇乙、甲素、乙素。邱楠楠等[20]采用超高效液相色譜-電噴霧質譜聯用（UPLC-ESI-MS/MS）技術明確了用紫紅參提取物給大鼠灌胃后從大鼠含藥血清中檢測到了14種入血成分，其中6種為紫紅參提取物中原型吸收入血的成分，其余可能為代謝產物或機體吸收紫紅參后產生的應激性成分。

2.2 復方中藥的血清藥物化學研究

中藥配伍使用是中醫臨床的一大特色，可以組合不同成分的中藥，通過不同成分的協同和拮抗，發揮協同調節機體的作用。但是因為中藥成分復雜，明確配伍使用的復方制劑中的有效成分和毒副作用也十分重要。唐崢等[21]采用超快速液相色譜技術（UFLC）明確了用梔子大黃湯給大鼠灌胃后大鼠血中有21個入血成分，其中12個為代謝產物，9個為原型成分，經與對照品比較發現，3個原型入血成分分別為京尼平苷、蘆薈大黃素和大黃酸。郭輝等[22]通過液相色譜分析法發現大鼠經大黃附子湯灌胃后，分離的血清中含有18種入血化學成分，其中14種為機體代謝產物，4種為藥物原型成分。劉佳麗等[23]采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測法（UPLC-PDA）明確了用逍遙散乙醇提取物的石油醚萃取物給大鼠灌胃后，血清中有20個入血成分，其中12個為原形成分，分別來源于柴胡（9個）、當歸（2個）、白術（1個），另外8個為代謝產物。程健等[24]采用液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）明確了通塞脈微丸中綠原酸、芹糖甘草苷、毛蕊異黃酮苷、木犀草苷、甘草苷、阿魏酸、異甘草苷、哈巴俄苷、甘草素和肉桂酸10種主要成分。

3 中藥血清藥理學與血清藥物化學協同的中藥藥效物質基礎研究

安全性與有效性是中藥臨床應用的關鍵。明確中藥的有效成分及藥效評估一直是制約中藥現代化發展的難題。在中藥基礎研究過程中，竇志華等很早就提出以血清藥理學和血清藥物化學為基礎的中藥藥效物質基礎研究，確立了中藥基礎研究的主要思路。中藥藥效物質基礎研究是指以血清藥理學與血清藥物化學協同研究為基礎，運用液相色譜分析法等方法明確含藥血清藥理效應與指紋圖譜化學成分峰面積或藥源性成分含量的關聯性，闡明藥物成分及其藥理學效應譜效、量效關系的研究方法[25]。

3.1 血清藥理學與血清藥物化學的有機結合

安莉萍等[26]研究了復方五仁醇膠囊，通過血清指紋圖譜結合藥效評價，發現五味子、木脂素類成分與保肝作用相關，五味子單劑與復方五仁醇膠囊藥效評價相當，指紋圖譜分析提示木脂素類成分是保肝作用的主要成分。田友清等[27]通過香青蘭醇及其含藥血清對心肌細胞缺氧/復氧損傷的藥效評估，證實了香青蘭醇及其含藥血清具有缺氧/復氧損傷能力，提示香青蘭具有心肌保護作用。血清藥理學和血清藥物化學的協同研究，不僅可以對藥物及其組分進行藥理效應評價，同時可以明確不同組分入血后的代謝過程，從而反映真實的藥效物質基礎。

3.2 譜效、量效關系分析數據處理方法

人工匹配是物質分析的基本方法，通過比較分析不同血清的二維分析圖譜，進而鑒定出藥物入血后的移行成分。但是，人工匹配難度大，同一保留時間可能有多種流出物質，容易造成數據浪費。主成分分析是對傳統血清藥物化學研究方法的補充，其目的是將多指標轉變成少數幾個綜合性指標。吳賢波等[16]用主成分分析法對實驗數據進行處理后確定了烏梅的入血成分及其代謝產物。隨機森林法是一種以分類樹為基礎的計算方法，可以預測多達幾千個解釋變量的作用[28]。徐丹[29]通過建立譜效關系，運用隨機森林法發現多種頭花蓼提取物含藥血清，均具有抑制炎癥因子釋放的作用，其作用可能是通過促進機體大量釋放某些具有抗炎作用的內源性分子而達到的。以上3種方法中主成分分析法與人工匹配相比能更客觀、全面地分析藥材入血成分及其代謝產物。隨機森林法更加適用于大數據多分類變量的處理[30]。

4 思考與展望

近年來，中藥血清藥理學和血清藥物化學相結合的方法被廣泛應用于中藥藥效物質基礎及其藥理作用機制的研究中，血清藥物化學與血清藥理學的結合不僅有助于揭示中藥多組分多靶點協同藥效學的特點，而且有助于分析和比較血清中的移行成分并鑒定體內直接作用物質，是中藥藥效研究的物質基礎[31]。

中藥血清藥理學與血清藥物化學的提出，推動了中藥現代化、國際化的進程。但仍然存在很多問題，含藥血清的研究方法主要用于口服給藥，對非口服給藥以及口服不吸收僅作用于胃腸黏膜表面的藥效成分難以評價。同時，該方法的研究周期相對較長[32]。含藥血清制備和滅活過程會使一部分重要化學成分損失或變化，而且含藥血清成分復雜，檢測、分離及富集有效單體也有一定困難[33]。所以，仍然有許多問題（如實驗動物是否需要造模、給藥次數和采血時間、血清與血漿的選擇等）需要我們進一步研究和探討。