Hartley豚鼠生物凈化群體建立及微衛星遺傳質量分析

范 濤 武衛國 馮 賓 劉佐民 柳全明

(中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

剖腹產凈化是實驗動物常用生物凈化手段之一。對于封閉群品系,剖腹產凈化會產生“奠基者”效應而影響群體的遺傳特性[1]。通過人為選擇,群體中僅有部分個體進入到了下個階段的繁育體系中,從而降低群體的多態性,同時,群體有效含量的減少,會加速近交系數上升速率,降低群體雜合度。然而,種群的凈化又是維持微生物等級(SPF級)必不可少的環節,因此,在每次凈化建群后,必須對遺傳質量進行監測。

微衛星DNA(microsatellite DNA)具有基因組分布廣、多態性高、重復性好等優點,用于實驗動物遺傳檢測的研究已開展多年[2-6]。近幾年,實驗大、小鼠微衛星DNA遺傳檢測方法正在制定相應的國家標準,以彌補我國實驗動物分子遺傳檢測方面的空白[7]。豚鼠是常用的實驗動物之一,大量研究表明[8-13],微衛星DNA方法同樣適用于封閉群豚鼠的遺傳質量評價。本實驗旨在通過剖腹產凈化獲得SPF級Harley豚鼠種群,通過遺傳檢測,了解凈化后種群的遺傳質量,為日后該種群的管L與應用提供基礎數據支持。

1 材料與方法

1.1 豚鼠剖腹產凈化

1.1.1 種鼠選擇:原生產群采用4組循環交配方案,每組包含15～20個繁殖單元,每個繁殖單元雌雄比例1∶5。分別從各組選擇7～8個繁殖單元,挑選其中的雌、雄個體(共計30個繁殖單元)作為種鼠(雄鼠確認可育,雌鼠為經產個體),按1∶1合籠一周后,雌、雄分開飼養。

1.1.2 剖腹產手術:從合籠開始計算,于65～70 d,用“綜合判斷法”(恥骨測量法+觀察法)[14]對受孕母鼠進行臨產期判斷,對臨產的孕鼠進行剖腹產手術。手術過程:孕鼠全身藥浴,CO2安樂死,仰臥保定,術部75%酒精消毒,蓋創巾,依次剪開孕鼠皮膚和腹壁,暴露子宮,用剪刀、鑷子分離子宮,止血鉗封閉雙側子宮角與宮頸,剪斷,將整個子宮摘下,通過渡槽傳入無菌隔離器中,在隔離器內,剪開子宮壁,暴露胎兒。胎兒取出后迅速擦拭口鼻,促進其自主呼吸,隨后剪斷臍帶,從剖腹產到仔鼠取出,控制在3 m in內完成。成活仔鼠在隔離器內分籠飼養,編號,溫度控制在28～30℃,用人工乳飼喂3～4次/d,飼喂至7日齡,隨后逐步改喂全價顆粒飼料。

育成的個體作為種鼠,分為 4組,按照 GB 14923—2010中封閉群循環交配方法進行組合,交配繁殖,獲得F1代。

1.2 豚鼠微衛星遺傳檢測

根據文獻[10-11],選擇豚鼠基因組中18個具有較高多態性的微衛星位點(表1),合成引物,引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成并進行熒光標記。已建立的SPF豚鼠群中,選取不同繁殖單元的25只個體,采集耳郭組織樣本,酚/氯仿法提取全基因組DNA,稀釋至50～100 ng/μL,分別對每個樣本進行18個位點的PCR擴增。產物進行微衛星STR掃描。

數據統計分析:使用Gene Marker 2.2讀取STR掃描結果,判斷等位基因大小,通過 PopGene 1.32計算各位點觀察等位基因數、有效等位基因數、Shannon信息指數、觀測雜合度、期待雜合度等指標,用PIC_CALC分析計算每個位點多態性信息含量(PIC)。對各位點進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(P值)。

表1 18個豚鼠微衛星位點相關信息Table 1 Characteristics of 18 microsatellite loci from guinea pig

2 結果

2.1 剖腹產結果

通過剖腹產,共獲得仔鼠85只,成活56只,離乳 47只(23雄、24雌),成活率 65.9%,離乳率83.9%(表 2)。

表2 豚鼠剖腹產結果Table 2 The results of cesarean section of guinea pigs

2.2 微衛星遺傳檢測結果

實驗結果中,除1個樣本未擴增出的位點較多,未納入統計(實際統計24個樣本),其余樣本在18個位點上均得到擴增產物,經STR掃描后,確定產物大小并進行分型,計算等位基因數、雜合度、多態信息含量等參數(表3)。

本豚鼠群共檢測到 81個等位基因,平均 4.5個,平均觀測雜合度 0.5694,平均期望雜合度0.5869,平均雜合度0.5747,該群具備較L想雜合度。多態性信息含量是表示位點多態性高低的一個指標,18個微衛星位點中,12個位點呈高度多態性(PIC>0.5),4個位點呈中度多態性(0.25

根據 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結果(表4),18個位點中有14個位點符合H-W遺傳平衡,位點 HZ086呈現純合狀態,HZ074、Cpo13、Cpo6 3個位點顯著偏離H-W遺傳平衡(P<0.05)。

表3 Har tley豚鼠封閉群在18個微衛星位點上的遺傳多樣性Table 3 Genetic variation for 18 microsatellite loci in Hartley outbred colony

表4 Hartley豚鼠封閉群Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Table 4 Exact test probability of Hardy-Weinberg genetic equilibrium of Hartley outbred colony

對比2014年相同遺傳位點檢測數據[11](表5),剖腹產前、后的群體,分別檢測到 85個(平均4.7個)和81個(平均4.5個)等位基因,平均觀測雜合度為 0.5077和0.5694,平均期望雜合度為0.5875和0.5869;平均多態信息含量(PIC)分別為0.526和0.522,剖腹產前、后群體均具備較L想的雜合度,維持著高度多態性。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結果對比,原種群在18個位點中有4個顯著偏離H-W遺傳平衡,而凈化后的群體有3個位點顯著偏離,1個位點呈現純合狀態(位點HZ086)。

表5 凈化前群體遺傳多樣性與H-W平衡檢驗Table 5 Genetic diversity and HWE test of the colony beforedecontamination

3 討論

豚鼠孕期較長,妊娠期60～70 d,剖腹產手術實施越接近臨產期成功率越高,同時,手術操作過程也是影響成活率的主要因素之一。本次實驗采取觀察與恥骨測量相結合來的方法綜合判斷臨產期,剖腹產成活率達為65.9%,低于有關文獻報道[14-15],這可能與經驗積累與技術熟練程度有關。在本實驗過程中還發現,頭胎母鼠剖產得到的仔鼠活力較低,很難有自主呼吸,而使用經產母鼠,后代活力有較大改善,這也是影響剖腹產成活率的又一因素,具體差異還需進一步研究。

Hartley豚鼠屬于封閉群實驗動物。封閉群是指不從外部引入新個體的條件下,以非近交方式繁殖生產的實驗動物種群。對于封閉群動物遺傳質量控制,主要表現在保持其遺傳組成具有較高的雜合性,同時所有基因的相對頻率保持穩定。影響群體遺傳多樣性評價可靠性主要有兩個方面,一個是選擇的樣本對總體的代表性,另一個是遺傳標記對基因組的代表性。朱亮等[8]應用8個微衛星位點對群體中72個個體進行遺傳,以評價其封閉群遺傳質量;李芳芳等[11]通過25個微衛星位點檢測比較了兩個封閉群豚鼠間的遺傳差異;劉迪文等[13]應用45個微衛星位點評估了三個遠交系豚鼠的遺傳結構,同時篩選出性狀基因定位有關位點,為豚鼠育種提供基礎數據。本實驗從群體中每個繁殖單元都選取了動物個體(共25只),同時通過文獻選擇了18個多態性較高的微衛星位點,用于反應群體的遺傳概況,較為合L。通過與剖腹產前種群遺傳檢測結果進行對比,種群遺傳多樣性保持較好,但隨著代次的增加,部分位點已出現純合狀態,這提示出飼養過程仍存在未實現隨機交配與近交的狀況發生,這是封閉群經常出現的問題。封閉群實驗動物在保種繁殖的過程中,為了避免近交系數上升過快,要維持足夠的有效群體含量,而保證群體有效含量的方法就是在封閉群中各家系內廣泛選留種用個體。剖腹產凈化建群的過程,即一次留種過程,選種需要在原群體中廣泛選育,才能盡可能地保持原群體的遺傳多樣性,同時,定期的遺傳監測與嚴格的避免近交操作在封閉群飼養管L中是必要的。根據遺傳檢測結果,此次凈化后的豚鼠種群在遺傳上符合封閉群實驗動物遺傳特征。