基于HPLC主要成分含量分析的安徽地產(chǎn)半夏質(zhì)量評價(jià)

劉宏　張穎　秦亞東

摘要：目的：利用高效液相測定全國主要產(chǎn)區(qū)半夏中的琥珀酸、胸苷、腺苷、鳥苷及肌苷含量，依此為依據(jù)，評價(jià)安徽地產(chǎn)藥材半夏質(zhì)量，并建立和優(yōu)化半夏質(zhì)量評價(jià)方法。方法：Agilent SB-C18色譜柱，甲醇-0.1%乙二胺水溶液，梯度洗脫，流速0.8mL·min檢測波長249nm，進(jìn)樣量10μl，柱溫為25℃。結(jié)果：不同產(chǎn)地半夏琥珀酸、胸苷、腺苷、鳥苷及肌苷含量差異大，安徽產(chǎn)半夏上述成分含量較高且相對均衡。結(jié)論：安徽地產(chǎn)藥材半夏質(zhì)量優(yōu)良，可以作為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源進(jìn)行培育和栽培;同時(shí)，該方法穩(wěn)定可靠，簡便易行，可用于半夏質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：半夏;安徽;成分;含量

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

隨著現(xiàn)代中國社會(huì)老齡化的到來，社會(huì)對中藥材及中成藥的需求越來越大，中藥對一些慢性病及疑難雜癥往往有一些獨(dú)到的療效，也越來越引起社會(huì)的廣泛關(guān)注，而中藥飲片的質(zhì)量無疑最為關(guān)鍵，野生資源減少，種植產(chǎn)品占比增加，而種植產(chǎn)品質(zhì)量往往與產(chǎn)地、種源、采收加工的規(guī)范性密切相關(guān)，其中不同產(chǎn)地的質(zhì)量評價(jià)尤為重要。

半夏，來源于天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖。半夏性溫、味辛，有一定毒性，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效?，F(xiàn)代藥物分析證明，半夏中主要含有鳥苷、肌苷、胸苷等多種核苷類成分，還有有機(jī)酸、生物堿、黃酮、氨基酸類等成分，且不同產(chǎn)地、加工炮制品，各類成分含量差異較為明顯?，F(xiàn)代藥理研究表明，半夏主要有鎮(zhèn)咳祛痰、止嘔的功效，此外，在胃潰瘍、凝血、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、扛癲癇等方面也有一定效果。半夏藥材在全國分布極為廣泛，甘肅、河北、安徽、貴州、新疆、湖北、江西均有分布，其中以甘肅西和縣產(chǎn)量最高，約占全國產(chǎn)量的三成，但野生資源日益匱乏，一些優(yōu)良品種甚至難尋蹤跡，安徽作為半夏的歷史產(chǎn)區(qū)，歷來品質(zhì)較好，如阜南和潁上的“潁半夏”，貴池的“匯半夏”，舒城的“舒半夏”，特別是阜南焦坡的“焦半夏”，歷史上都非常有名，本文試圖從半夏中四種主要核苷類成分胸苷、腺苷、鳥苷、肌苷及一種有機(jī)酸琥珀酸的含量出發(fā)，與全國主產(chǎn)區(qū)半夏質(zhì)量進(jìn)行對比，對安徽地產(chǎn)半夏的質(zhì)量做出評價(jià)。

1儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（G4212B型DAD檢測器，G1312B型二元泵，G1367E型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1322A型脫氣機(jī)）;Discovery DV215CD分析天平（美國奧豪斯公司）;Sigma 2-16KL高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）;KQ250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;XL-130多功能粉碎機(jī)（永康市小寶電器有限公司）。

1.2試藥

對照品：胸苷（批號(hào)：101215-201401），購自中國食品藥品檢定研究所，腺苷（批號(hào)：200305）、鳥苷（批號(hào)：200917）、肌苷（批號(hào)：200814）、琥珀酸（批號(hào)：200411）、均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。甲醇為色譜純，購自美國TEDIA公司，乙醇、鹽酸、乙二胺為分析純，水為娃哈哈純凈水。

八個(gè)樣品為貴池野生品種（S1）、舒城種植品種（S2）、阜南種植品種（S3），以上三個(gè)品種為自采品種，甘肅野生品種（S4）、甘肅種植品種（S5）、河北種植品種（S6）、貴州野生品種（S7）、湖北野生品種（S8）均購自亳州藥材市場。以上品種經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校趙寶林教授鑒定為Pinellia ternata（Thunb.） Breit.的塊莖。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Agilent SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，1.5μm）;流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%二胺水溶液，梯度洗脫。0～10min，B相99.9%～99%;10～15min，B相99%～95%;15～25min，B相95%～90%;25～35min，B相90%～82%;35～45min，B相82%～70%;45～60min，B相70%～50%。流速0.8mL·min，檢測波長249nm，進(jìn)樣量10μl，柱溫為25℃。在上述色譜條件下，5種對照成分均可以得到很好的分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10000，見圖1及圖2。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液制備

取上述八個(gè)品種半夏，粉碎，過60目篩，分別精密稱取約2.5g，置于具塞錐形瓶中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的鹽酸乙醇（70%）溶液（500ml乙醇+166.5ml水+17ml濃鹽酸）50ml為溶劑，精密稱定質(zhì)量，超聲提取45min（ 250W，40KHz），放置片刻，再次精密稱定質(zhì)量，用上述溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，放置30min，取上清液適量，離心10分鐘（10000轉(zhuǎn)/分鐘），上清液經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.2對照品溶液制備

分別精密稱取胸苷8.2354mg，腺苷8.6485mg，鳥苷9.0124mg，肌苷8.8321mg，琥珀酸15.2314mg，置于10ml容量品中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液。取上述對照品貯備液各1.0ml，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾，即可獲得各對照品溶液。

2.2.3混合對照品溶液制備

取2.2.2項(xiàng)下的對照品貯備液各1ml，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，混合后加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系和線性范圍考察

取2.2.2項(xiàng)下五種對照溶液，分別取2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.1ml，加甲醇0、0.5、1.0、1.5、1.75、1.90ml，制成各標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度濃度進(jìn)樣溶液，按照2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，計(jì)算各成分峰面積平均值，再以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸收峰峰面積為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，表明各成分在各自濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

2.3.2精密度試驗(yàn)

取2.2.3項(xiàng)下的混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)樣量10ul，平行試驗(yàn)6次，分別記錄各成分峰面積，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD，n=6），琥珀酸、肌苷、鳥苷、腺苷、胸苷的RSD分別為1.21%、0.58%、1.04%、0.63%、0.84%，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)

取安徽省貴池縣所產(chǎn)野生半夏（S1）品種，按照2.2.1項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24小時(shí)測定，計(jì)算琥珀酸等上述五種化合物色譜峰面積，計(jì)算RSD，琥珀酸、肌苷、鳥苷、腺苷、胸苷的RSD分別為1.54%、1.05%、2.25%、1.73%、0.95%，1.69%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.4加樣回收率試驗(yàn)

取安徽貴池野生品種6份，每份2.5g，按照2.2.1制備提取液，取試液10ml，加入2.2.2項(xiàng)下的對照品貯備液各50ul，混合均勻，測定各成分加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.4樣品有效成分含量測定

對上述8批次不同產(chǎn)地半夏中琥珀酸、肌苷、鳥苷、腺苷及胸苷的含量進(jìn)行測定，每批平行測定六次，取各成分峰面積平均值，代入回歸方程，最后根據(jù)提取液體積，計(jì)算出不同產(chǎn)地半夏中五種成分的含量，結(jié)果見表3。

3結(jié)果與討論

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地各成分含量差別非常大，最高最低含量相差倍數(shù)為：琥珀酸5倍左右，肌苷6倍左右，鳥苷約3倍，腺苷19倍，胸苷約8倍。其中貴州所產(chǎn)半夏，肌苷和腺苷含量明顯低于其他產(chǎn)地，但琥珀酸含量最高，湖北野生品種腺苷含量最高，其他成分含量也不錯(cuò)。甘肅所產(chǎn)兩個(gè)品種的各成分含量比較均衡，目前市場上甘肅產(chǎn)半夏占比較大，從試驗(yàn)結(jié)果上也得到了驗(yàn)證。而安徽的三個(gè)產(chǎn)區(qū)，琥珀酸和腺苷的含量明顯高于甘肅產(chǎn)半夏，肌苷和胸苷含量略低與甘肅產(chǎn)半夏，鳥苷的含量低于甘肅產(chǎn)半夏，且五種成分的含量在8個(gè)產(chǎn)地中也相對均衡，說明安徽地產(chǎn)半夏具有很好的種植前景，其品種可以作為半夏的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源加以研究和培育。研究還表明，野生品種相對于種植品種，各成分含量最高的品種大多數(shù)為野生品種，但由于取樣數(shù)量相對較少，該結(jié)果是否具有代表性，是否表明半夏藥材在種植過程中會(huì)產(chǎn)生品質(zhì)下降，有待擴(kuò)大試驗(yàn)批次和產(chǎn)地進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)所用的色譜條件比較簡單，通用性強(qiáng)，測定方法簡單快捷，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性好，也為半夏藥材種植、采收、炮制加工、存儲(chǔ)時(shí)進(jìn)行質(zhì)量檢測提供了一個(gè)新的選擇。

作者簡介：劉宏，男，副教授，主要從事中藥有效成分研究;張穎，女，副教授，主要從事中藥成分分析研究。