斑馬魚模型與腦出血遺傳分子機制研究進展

王雪琪 郭睿 陳雨麒 劉翼 游潮 王業啟 田蕊

腦出血是老年人群最為常見的急性進行性腦血管病，具有高發病率、高病死率、高病殘率的臨床特點，同時具有明顯的遺傳傾向［1］。目前對于腦出血的發病機制尚不十分清楚，一般認為與高血壓、腦血管畸形、顱內動脈瘤、腦血管淀粉樣變、顱腦創傷或抗血栓藥物等危險因素有關［2?5］。有研究顯示，影響腦血管和血?腦屏障（BBB）發育的相關基因突變如NOTCH3基因突變，可能與腦血管畸形、顱內動脈瘤和腦血管淀粉樣變相關性腦出血密切相關［6］。血?腦屏障構成單元之間共同作用以維持腦組織氧氣、營養物質輸送與能量代謝平衡，并保護大腦免受毒素與病原體侵害，其構成單元發生病變即可造成腦血管結構或功能障礙。目前針對血?腦屏障的動物實驗大多采用大鼠、小鼠、猴或斑馬魚等作為疾病模型［7］，其中斑馬魚因具備血管結構易觀察、基因和藥物靶點相對保守，并可進行高通量表型篩選等優勢，有利于對腦出血相關遺傳因素進行全面剖析而成為較為理想的腦血管病遺傳分子學研究模型生物。本文重點對基于斑馬魚腦出血模型血?腦屏障調控的遺傳分子學研究與腦出血致病機制的相關研究進展進行闡述，以加深對其發病機制的理解，并協助制定相應防治策略。

一、血?腦屏障的形成、構成單元及其功能

1.血?腦屏障的形成在大部分哺乳動物胚胎期，當神經周圍血管與神經開始相互交聯時，功能性血?腦屏障即已逐漸形成。Ben?Zvi等［8］采用熒光染料標記的方法對小鼠不同胚胎時期血?腦屏障滲漏情況進行鑒定，Dextran等熒光染料經胚胎小鼠肝臟回流至血管，并最終進入血?腦屏障；經觀察發現，Dextran滲漏自胚胎13.5天逐漸減少，至15.5天已無滲漏，標志著功能完整的血?腦屏障業已形成，而且此過程是在胚胎發育期逐漸形成的。動物實驗顯示，斑馬魚胚胎受精后20小時即可在其后腦腹側觀察到熒光染料標志物，此為與血?腦屏障形成密切相關的神經周圍血管?原始后腦通道（PHBC）部位［9］，提示功能性血?腦屏障在斑馬魚胚胎第4天即已基本形成［10］。上述研究結果表明，功能性血?腦屏障形成于斑馬魚胚胎發育過程中，與小鼠模型相比，采用該模型研究血?腦屏障相關疾病所需周期更短。然而，新近研究發現，斑馬魚功能性血?腦屏障的形成呈現前后軸特性，經窖蛋白（Cav?1）標記的囊泡數目從前腦向后腦逐漸減少，直至胚胎第6天才形成功能完整的血?腦屏障［11］。

2.血?腦屏障構成單元與功能血?腦屏障系分隔中樞神經系統和外周血液循環系統的多細胞血管結構，包括內層特化的內皮細胞（EC）、中間層的周細胞（pericyte）、外層的星形膠質細胞（astrocyte）和基膜（BM）［12］。血?腦屏障構成單元在維持其功能方面發揮關鍵作用，若內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞發生結構或功能變異，則可導致其完整性和通透性改變［13］，進而影響腦內物質與能量代謝平衡，在危險因素的作用下極易誘發腦出血。內皮細胞對維持血?腦屏障的完整性至關重要。血?腦屏障內皮細胞具有特化的緊密連接，分別由咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、緊密連接黏附分子（JAMs）和三細胞緊密連接蛋白（Tricellulins）所組成，上述蛋白富集于血?腦屏障內皮細胞，維持血?腦屏障完整性。既往研究表明，盡管Ocln基因敲除小鼠緊密連接發育正常，但Ocln基因缺失可影響緊密連接蛋白ZO?1的定位［12］。斑馬魚Cldn5有兩個同源基因——Cldn5a和Cldn5b，Cldn5b基因于受精后48小時特異性表達于腦血管內皮細胞，而Cldn5a基因廣泛表達于脈絡叢室管膜細胞［9］。針對Cldn5基因敲除斑馬魚的最新研究發現，Cldn5基因還具有自噬激活功能，可通過調節自噬而保護血?腦屏障的完整性，為血?腦屏障功能紊亂導致的腦血管病提供潛在的治療策略［14］。周細胞是包覆神經鞘側毛細血管上的一類壁細胞，位于內皮細胞、星形膠質細胞與神經細胞之間，在血?腦屏障信號轉導過程中發揮重要作用。內皮細胞表達血小板源性生長因子?β（PDGF?β），招募表達Pdgfrb基因編碼的血小板源性生長因子受體?β（PDGFR?β）的周細胞，從而促進周細胞包覆在內皮細胞外側，從而調控血?腦屏障的完整性［15］。Ando等［16］通過轉基因魚的 方法對斑馬 魚胚胎Pdgfrb基因進行標記，觀察到斑馬魚胚胎于受精60小時即出現周細胞與腦血管的交聯。與哺乳動物類似，敲除該基因可以造成周細胞損傷，此時血?腦屏障則難以發揮其“屏障”作用［17］。另外，由Foxf2基因編碼的轉錄因子Foxf2同樣表達于中樞神經系統和周細胞，可刺激Pdgfrb基因表達、激活轉化生長因子?β（TGF?β）信號轉導通路，Foxf2基因表達缺乏時，TGF?β信號轉導通路受阻，進而影響血?腦屏障結構與功能的完整性，使通透性增加，血?腦屏障滲漏［12］。斑馬 魚fox2a、fox2b、pdgfrβ和notch3基因具有相似的表達譜，fox2b突變可導致周細胞數目減少，以及周細胞和平滑肌的分子標記基因acta2表達下調［18］。星形膠質細胞覆蓋于毛細血管之上，構成神經血管單元的最外層，對維持血?腦屏障結構完整、發揮正常功能至關重要。其上的終足（end?feet）能夠輔助星形膠質細胞接觸腦血管外的細胞外基質（ECM），星形膠質細胞產生的音猬因子（shh），可上調內皮細胞緊密連接蛋白Occludin和Claudins的表達，從而維持血?腦屏障完整性和神經系統的免疫平衡［19］。Lamc1基因編碼的層粘連蛋白能夠誘導內皮細胞緊密連接相關蛋白表達，并促進星形膠質細胞水通道蛋白4（AQP4）表達，星形膠質細胞層粘連蛋白缺失致AQP4表達下降，內皮細胞緊密連接相關蛋白表達水平降低，血?腦屏障完整性受損［20］。然而，根據Gleiser等［21］2016年公布的研究結果，并未在免疫標記斑馬魚AQP4后觀察到“極化”現象，提示與其他哺乳動物不同，斑馬魚模型星形膠質細胞不表達AQP4，斑馬魚星形膠質細胞如何與神經血管單元進行信息交流和信號轉導尚不明確，有待進一步研究證實。基膜是一類維持血?腦屏障神經血管單元結構完整的細胞外基質，主要由Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白和其他糖蛋白所組成，是細胞間進行信號轉導的重要樞紐，能夠觸發細胞遷移、增殖和存活信號級聯反應。研究顯示，整合蛋白（Integrin）可介導細胞外基質驅動的調控WNT信號和TGF?β信號，敲除星形膠質細胞和細胞外基質中的Itgav基因可誘發小鼠模型的腦出血表型，提示Itgav基因對維持血?腦屏障功能發揮重要作用［22］。Hübner等［23］對WNT信號缺失斑馬魚胚胎進行研究，發現WNT信號缺失斑馬魚胚胎可于發育后期發生腦出血，表明WNT信號對血?腦屏障的發育至關重要。

由此可見，中樞神經系統內皮細胞和神經血管單元共同維持血?腦屏障結構完整性并維持其正常生理功能，不同組織結構之間相互影響、相互作用。血?腦屏障以及相關神經血管單元受多種遺傳因子的調節，其中任何基因的異常表達都會影響血管的屏障作用，在危險因素的作用下誘發腦出血。通過明確導致腦出血的突變基因，有望篩選出與腦出血預后相關的藥物靶點，并對遺傳學高危人群進行一級預防，延緩發病時間，降低死亡率。

二、斑馬魚腦出血模型

1.模型構建及其行為學分析目前主要采用基因編輯法和化學法構建斑馬魚腦出血模型。（1）基因編輯法：通過對與血?腦屏障結構和功能完整性相關基因的改造，構建腦出血模型［17］。（2）化學法：對斑馬魚胚胎進行水浴孵育并使其吸收他汀類藥物，誘發斑馬魚幼體腦出血或增加其發生腦出血的概率，如膽固醇代謝通路抑制劑3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）［24］。對腦損傷斑馬魚的運動行為分析發現，其異常游動模式與腦損傷程度呈強相關，以旋轉（rotating）或繞動（circling）為主［25］。運動行為記錄顯示，腦損傷斑馬魚幼體10分鐘累計運動距離明顯短于正常斑馬魚幼體，且腦損傷程度與運動距離呈負相關，通過記錄斑馬魚運動距離、速度和游動模式等行為，可初步判斷其幼體腦損傷情況［26?27］，隨著激光共聚焦實時成像技術用于成年斑馬魚模型腦出血后神經行為學的研究，期待構建新型模型，加強行為學觀察分析。

2.模型優勢與其他哺乳動物腦出血模型相比，斑馬魚腦出血模型具有以下優勢：（1）觀察周期短。斑馬魚胚胎形成后第1天腦血管即開始同步形成，第2天通過傳統光學顯微鏡可直接觀察到斑馬魚腦出血情況［25］。（2）斑馬魚轉基因技術結合激光共聚焦顯微鏡在腦血管發育、血?腦屏障形成，以及腦出血研究方面具有獨特的優勢。首先，胚胎階段斑 馬 魚 身 體 透 明，可 通 過Tg（flk1：EGFP；gata1：dsred）雙轉基因斑馬魚實時觀察腦血管中紅色熒光標記的紅細胞滲漏至血管外的整個過程［25］。其次，在細胞水平上，可通過激光共聚焦顯微鏡結合Tg（flk1：EGFP）、Tg（fli1a：EGFP）、Tg（fli1a：dsRed）、Tg（kdrl：mcherry）［28］等各種轉基因斑馬魚模型觀察腦血管的發育過程；依據周細胞分子標志物PDGFR?β構建Tg（Pdgfrb：Gal4：UAS：GFP）雙轉基因斑馬魚模型，觀察其腦血管周細胞發育過程［16］。再次，可通過 分 子 水 平 的Tg（Glut1b：mCherry）和Tg（Plvap：eGFP）等轉基因斑馬魚模型評價血?腦屏障的形成和成熟過程［29］。在維持血?腦屏障功能完整性方面，可以利用Tg（flk1：EGFP）、Tg（fli1a：EGFP）［28］等轉基因斑馬魚模型實時評價血?腦屏障中Dextran等熒光染料滲漏程度，判斷血?腦屏障完整性。注射DAPI等染料到Tg（flk1：EGFP）等轉基因斑馬魚模型可用于血?腦屏障完整性的定量研究［30］，隨著更多分子標志物的發現，可以對斑馬魚血?腦屏障完整性進行定性和定量評價。（3）利用斑馬魚腦出血模型快速篩選腦出血相關化合物、抑制劑和易感基因。Yu和Li等［25］通過42℃水 浴 斑馬魚胚胎30分 鐘模擬高血壓引起的血管擴張，以篩選腦出血易感基因。（4）斑馬魚腦出血模型血?腦屏障具有保守性，其與人類血?腦屏障結構和功能相關遺傳因子之間具有高度保守性，斑馬魚血?腦屏障在結構與分子組成上同小鼠、人類血?腦屏障基本相似，且斑馬魚內皮細胞亦可表達claudin5b、zo?1、glut1b和plvap等血?腦屏障相關基因［10］，可為腦出血機制研究提供便利。新近研究顯示，cldn5a基因是斑馬魚的同源基因，在血?腦屏障和脊膜叢（CP）屏障中高保真表達，表明人類和斑馬魚血?腦屏障、脊膜叢屏障之間存在一定的保守性［9］，且cldn5a基因亦參與維持人類血?腦屏障的完整性。血管內皮鈣黏著蛋白（VE?cad）對維持血?腦屏障完整性亦十分重要，可抑制斑馬魚體內編碼VE?cad蛋白cdh5同源基因表達，誘發斑馬魚胚胎腦出血事件，提示斑馬魚腦血管發生滲漏［31］。MFSD2A是人和小鼠血?腦屏障中不可或缺的結構，與野生型斑馬魚相比，通過基因編輯技術敲除斑馬魚mfsd2a基因后，于突變體斑馬魚體內注射Dextran染料40分鐘后即可見其血?腦屏障出現明顯的熒光擴散現象［11］，提示其血?腦屏障受損。然而，斑馬魚與其他哺乳動物在血?腦屏障形態上存在一定差異，構成斑馬魚血?腦屏障的星形膠質細胞雖然發揮重要功能，但并非與哺乳動物一樣可形成明顯的“終足”樣的結構覆蓋整個腦血管表面。

三、斑馬魚模型與人類腦出血疾病研究進展

隨著全基因組關聯分析（GWAS）、候選基因法、第二代測序技術（NGS）等新技術的發展，目前已經明確部分與人類腦出血疾病的相關基因。通過基因組測序對腦出血患者候選基因進行篩選，現已鑒定出THSD1、FOXC1、CECR1等多個腦出血相關基因［4，6，32］。近期開展的全外顯子組測序（WES）研究顯示，顱內動脈瘤破裂導致的蛛網膜下腔出血患者存在THSD1基 因 突 變［33?34］，這 一 結論經由斑馬魚 腦出血模型及腦出血模型小鼠實驗驗證，證實了THSD1基因通過調控內皮細胞焦點粘連的機制維持血?腦 屏障功能完整性［34］，提示THSD1基因功能缺失性突變可導致腦出血。通過對非免疫性胎兒水腫（NIHF）研究發現，非免疫性胎兒水腫可導致THSD1基因功能失活，進一步隨訪發現，大部分非免疫性胎兒水腫胎兒存在顱內血管瘤，以及血管瘤破裂所致腦出血，再一次證明THSD1基因缺失與腦出血相關疾病的發病機制密切相關［35］。靶向全基因組關聯分析和全基因組測序（WGS）結果顯示，腦小血管病（CSVD）患者的FOXC1基因組序列存在錯義突變、片段重復和缺失，并經斑馬魚腦出血模型所驗證，注射嗎啉基（morpholino）沉默FOXC1基因可誘導斑馬魚腦出血［18］。其機制可能與抑制FOXC1基因使PDGF信號轉導功能障礙有關，繼而損害神經嵴遷移和壁細胞的招募，導致血?腦屏障完整性破壞誘發腦出血。CECR1基因編碼腺苷脫氨酶2（ADA2），其功能缺失性突變與一系列血管病和炎癥表型相關，其中包括早發、復發性腦卒中和系統性血管病變或血管炎［36］。研究顯示，出血性卒中患者血清ADA2及ADA2特異性酶活性明顯降低，而皮膚、肝臟和大腦活檢結果提示以內皮完整性受損、內皮細胞活化和炎癥為特征的血管病變，表明ADA2含量和活性與內皮細胞結構完整性和血管病變密切相關。敲除ADA2同源物的斑馬魚可出現腦出血和中性粒細胞減少，而注射未發生突變的人CECR1 mRNA則可預防斑馬魚腦出血和血管炎癥。

腦出血的常見病因還包括腦海綿狀血管瘤（CCM），迄 今 為 止 已 發 現CCM1（KRIT1）、CCM2（MGC4607）和CCM3（PDCD10）3個基因突變與腦海綿狀血管瘤相關，3個蛋白均可通過腦海綿狀血管畸形蛋白2（CCM2）形成復合體，并調節血管新生、血?腦屏障完整性，以及氧化損傷保護等一系列血管生物學進程［37］。斑馬魚的CCM同源基因包括ccm1、ccm2、ccm3a、ccm3b，基于斑馬魚、小鼠和人類CCM1/2/3基因功能缺失具有共同的心血管表型，如血管異常增粗或擴張、血?腦屏障內皮細胞形成與融合明顯受損、心臟異常腫大、心內膜墊在房室管形成失敗 等 缺 陷［38］，Otten等［39］以 斑馬魚ccm2突變 體的心臟腫大表型為模型進行小分子藥物篩選研究，意外發現小分子藥物IRM?3能夠明顯緩解小鼠CCM2/3出血模型因CCM2/3突變導致的腦出血。

四、小結與展望

綜上所述，隨著腦出血發病低齡化趨勢和死亡率不斷攀升，基于遺傳分子學角度的腦出血致病機制研究顯得愈發重要。斑馬魚腦出血模型便于觀察腦血管結構，基因和藥物靶點相對保守，能夠進行高通量表型篩選，為腦出血遺傳分子機制的研究提供了便利條件。盡管斑馬魚腦出血模型在腦出血基礎研究中已占據一席之地，但如何利用全基因組關聯分析、候選基因法、第二代測序技術建立新的轉基因斑馬魚腦出血模型，用于探索遺傳因素在腦出血發病過程中的作用，確定腦出血防治藥物靶點，并進行藥物初步篩選和進一步評鑒，從而盡早為患者提出有效的疾病預防策略和治療手段，將成為該領域的熱門研究問題，仍尚待進一步探索。

利益沖突無