脫氧核糖核酸酶1與肝臟疾病關系的研究進展

王 娟，安家興，庹必光

遵義醫科大學附屬醫院消化內科 貴州遵義 563000

脫氧核糖核酸酶(DNase)是特異性靶向DNA的核酸內切酶。DNase中發揮主要作用的是DNase1家族，其主要功能為降解體內異常的DNA。DNase1家族屬于Tat D蛋白家族，現有DNase1、DNase1L1、DNase1L2和DNase1L3共4個成員，成員之間具有很高的序列同源性，但表達部位卻有很大差異[1]。DNase1是該家族最先被發現的成員，有助于清除循環中游離的DNA。缺乏DNase1時，血清中DNA/染色質復合物將會持續存在，導致自身抗體的形成。DNase1在系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、類風濕關節炎、干燥綜合征、甲狀腺自身免疫性疾病和炎癥性腸病患者的血清中活性降低[2-4]，是許多自身免疫性疾病(尤其是SLE)的危險因素[5-7]。DNase1是腎小管上皮細胞中消化DNA的主要核酸酶[8]，其功能障礙會導致嚴重的狼瘡性腎炎[9]。Dnase1已被證明可以成功地消化囊性纖維化中的游離DNA，可以清除黏液，達到治療目的[10]。

肝臟是體內一線免疫組織，每分鐘體內血液總量的30%會流經肝臟[11]。因此，血液循環中積累的DNA片段可以引起與肝臟相關的免疫反應，從而導致一系列肝臟疾病。Ludwig等[12]的研究表明肝臟是血清DNase1的來源之一，DNase1可能在阻止一些肝臟疾病的進展方面發揮重要作用。本綜述旨在闡明DNase1的結構和功能，闡明其在肝病發病機制中的作用，從而為該類疾病的診斷和治療提供更多選擇。

1 DNase1的結構和功能

DNase1是一種由283個氨基酸組成的核酸內切酶，相對分子質量為31 434。該基因位于16p13.3號染色體上，包含9個外顯子和8個內含子，這些內含子跨越15 kb基因組DNA[13]。DNase1包含一個特征性的 DNase結構域。DNase結構域是構成DNase1超家族(一種由重復突變產生的祖先基因)的基礎[14]。DNase1超家族通常作為磷酸水解酶來裂解DNA的磷酸二酯鍵[15]。DNase結構域高度保守，其中257個氨基酸殘基分散在整個一級序列中[16]，這些殘基也高度保守。Dlaklc[17]的研究表明這些保守的氨基酸殘基可能對催化作用更為重要。例如，His131是組氨酸殘基，可能是與DNA雙鏈的磷酸鹽發生靜電相互作用的位點[18]。但是在現階段，仍不清楚DNA在何處以及如何與酶結合。結構域包含四層α/β三明治基序[19]，可以形成三個疏水核，而這個疏水區域主要負責DNase1的結構穩定性和剛性。保證酶穩定性的其他因素包括分子內氫鍵、鹽橋、兩個二硫鍵(其中半胱氨酸170至206這一片段對活性至關重要)和兩個Ca2+結合位點[20]。Ca2+結合位點的存在可保護DNase1不被蛋白酶水解，防止半胱氨酸 170和206之間二硫鍵的還原[21]，參與還原酶的重新折疊[22]，穩定分子中的環區。DNase1活性取決于二價陽離子的存在，沒有二價陽離子時甚至無法檢測到DNase1活性，但是Zn2+和二價陽離子的螯合劑除外，它們會抑制DNase1活性[23]。還有一些情況也會使DNase1活性下降：與單體G肌動蛋白結合幾乎可以完全抑制DNase1的活性[24]；在高于80 ℃時，DNase1活性會完全喪失[25]；在pH4.5以下或pH9.5以上環境中DNase1也會喪失活性[26]。DNase1在DNase結構域之前包含一個長度為18～22個氨基酸的信號序列(N端信號肽)，該序列的功能是抑制DNase1活性[27]，并促進內質網轉運[1]。

DNase1是一種分泌蛋白，當N端信號肽被酶切后，成熟的DNase1將被轉運至核膜并保存在酶原顆粒中[1]。當細胞暴露于某些刺激時，DNase1從核膜中釋放出來并分泌到細胞外，參與壞死細胞的染色質分解。有兩個機制可阻止DNase1進入細胞核，以避免DNase1破壞正常核酸。一個是DNase1的N端信號肽可引導DNase1蛋白分泌至細胞外，或將其限制在內質網、高爾基體或核膜中[28]。第二個是DNase1缺乏核定位信號，因此其無法被跨核膜轉運蛋白轉運[29]。在細胞內(包括高爾基體和內質網等細胞器)和細胞外均可檢測到DNase1[1]。由于DNase1會與胞質溶膠中G肌動蛋白形成復合體，特異性抑制DNase1活性[30]，因此DNase1在細胞內不發揮作用。

DNase1以Ca2+/Mg2+依賴性方式優先切割雙鏈DNA，產生3’-OH/5’-P末端[26]。DNase1會優先切割“裸”DNA(無蛋白質的DNA)，尤其是小于150 bp的短基因片段，但是只能在體內蛋白水解酶的幫助下切割染色質。除此之外，DNase1傾向于將5’端切成T末端片段[31]。具體而言，在早期階段，DNase1會按照dT-dN、dN-dA和dG-dN的順序攻擊磷酸二酯鍵，但很少攻擊dC-dN鍵。在降解的后期，盡管在5’端對dA的偏好仍然存在，但在3’端對dT的偏好消失[25]。

2 人體內DNase1的來源和分布

人胰腺中負責外分泌的胰島細胞[32]和胃腸道中的杯狀細胞[33]可以分泌DNase1到消化道中，并且胰腺來源的DNase1活性最高[34]，所以最初DNase1被認為只是一種消化酶。DNase1在酸性環境中活性會降低甚至失活,關于DNase1如何在胃中被保存并發揮作用，目前人們提出了兩種假說[34]：第一種認為DNase1在經過胃的時候通過將它的原始結構改變成胃酸不能分解的形式而被保存下來；另一種認為DNase1通過翻譯后糖基化而獲得酸穩定性。Wroblewski等[35]在1950年報道DNase1也存在于人的血液中，血液中的DNase1通過核孔被動擴散或直接通過受損的核膜到達受損細胞，從而發揮降解DNA的功能[36]。Napirei等[37]指出血液中的DNase1主要由肝臟、甲狀腺、腦垂體和消化道(胃、十二指腸、小腸和大腸)分泌。泌尿生殖系統(腎臟、膀胱、附睪、腹側前列腺、副腺和卵巢)和內分泌組織(如甲狀腺和垂體)也會分泌DNase1[24,38-40]，并且在淚腺、眼和腸系膜淋巴結中也檢測到了DNase1[37]。有研究[41]表明DNase1活性調控受到雄激素的影響，所以男性泌尿系統和肝臟中DNase1活性明顯高于女性。

3 DNase1與肝臟疾病

到目前為止，肝臟已被證實為是血清中DNase1的來源之一，并且肝臟DNase1活性和血清DNase1活性存在平行關系[12]。在正常情況下DNase1不能進入細胞核，因此DNase1在肝臟和血液中均不發揮作用。但當肝臟發生炎癥或壞死時，肝細胞破裂并釋放出DNase1，肝臟和血清DNase1活性均升高。而增多的DNase1在清除壞死肝細胞染色質過程中發揮了重要作用，從而緩解或避免一系列由肝細胞壞死引起的肝臟疾病。目前雖然肝臟疾病與DNase1的關系還未研究透徹，但是多項研究[42-44]顯示DNase1活性會隨著肝臟疾病的進展而變化，提示DNase1有可能成為肝臟疾病診斷及預后判斷的生物指標。DNase1是體內分解循環中多余DNA的酶之一，在疾病發展期間或許可以通過人為調節DNase1活性從而達到治療疾病的目的。

3.1肝癌肝癌是癌癥相關第二大死亡原因[45]，其中肝細胞癌占肝癌的95%。癌栓是導致癌癥患者非腫瘤死亡的主要原因，而中性粒細胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)是導致肝癌血栓形成的重要因素之一。NET是在病原微生物入侵機體時由中性粒細胞釋放的染色質和各種酶原顆粒形成的網狀結構[46]。NET可以與紅細胞結合并充當血栓形成的支架[47]，影響組織血供從而損害細胞[48]，具有促炎和血栓形成的作用。血清中的DNase1可消化NET的DNA骨架，從而減少癌栓的形成[48]。循環游離DNA(cf-DNA)是存在于人體血液、尿液和其他體液中的游離DNA，由極短(<200 bp)的雙鏈DNA片段組成[49]。帶負電荷的cf-DNA會形成空間位阻，因此細胞外基質中高水平的cf-DNA可能會阻礙癌癥患者化療藥物的分布并降低藥物療效[50]。長度為147 bp的cf-DNA已被證實為核小體[49]。核小體是細胞死亡的副產物，具有高增殖指數的浸潤性腫瘤患者體內核小體釋放增多。DNase1可以降解cf-DNA，降低血漿核小體水平。研究[51]表明，肝細胞癌組織中核酸內切酶活性明顯低于正常肝組織，并且NET和cf-DNA濃度顯著增加。因此DNase1或可成為肝細胞癌化療反應的預測因素和預后生物標志物[52]。然而，重組DNase1是否能用于肝細胞癌的治療還需要研究證實。

3.2自身免疫性肝病自身免疫性肝病是一種由于人體免疫系統異常導致正常肝臟細胞受到攻擊的疾病。自身免疫性肝病是指包括原發性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和原發性硬化性膽管炎在內的一系列疾病。這些肝臟疾病的病因尚不清楚，并且在臨床治療中也存在許多困難[43]。DNase1是人體組織和血清中存在的一種核酸內切酶，其缺乏可能導致壞死性物質清除不良，在炎癥和免疫耐受喪失中起重要作用。細胞異常死亡時由于DNA片段未能被及時清除，導致DNA片段通過循環到達肝臟，進而觸發DNA驅動的自身免疫反應[53]。Gatselis等[43]研究發現上述3種自身免疫性肝病患者血清DNase1活性顯著低于正常人，但這3組患者血清DNase1活性無明顯差異。DNase1活性與原發性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎的發病有關，而血清DNase1活性升高可能是自身免疫性肝炎完全緩解的獨立預測因子[43]。通過調節DNase1活性治療自身免疫性肝病可能是一個新的研究方向。

3.3藥物性肝損傷藥物性肝損傷病死率很高，也是臨床上急性肝功能衰竭的主要原因之一[54]。對乙酰氨基酚是一種廣泛使用的鎮痛藥，其過量使用可導致藥物性肝損傷[55]。肝臟受到毒性藥物刺激后，儲存在肝細胞以及肝竇內皮細胞核和線粒體中的DNA被釋放到細胞質中[44]。藥物再誘導細胞質中的DNA以一種不依賴于壞死的機制從肝細胞釋放到肝竇微血管中，通過血液循環，在肝微循環和肝實質中沉積[56]。細胞外沉積的DNA可導致肝細胞壞死以及無菌性炎癥的發生[44]。肝損傷早期出現代謝障礙會阻礙DNase1的生成，從而促進肝臟DNA的沉積。研究[44,57]表明，對乙酰氨基酚中毒后，DNase1可切割細胞外DNA，顯著抑制對乙酰氨基酚介導的肝臟炎癥和損傷。而對乙酰氨基酚給藥后血清DNase1活性會逐漸增加[57]。因此，對細胞外DNase1的識別管理可能是治療藥物誘發的肝損傷的關鍵手段之一。

3.4乙型肝炎乙型肝炎是一種常見的疾病，由于基因組HBV病毒庫的持續存在，如游離型共價閉合環狀DNA和染色體整合的HBV DNA，患者在停藥后經常會復發，這給乙型肝炎的治療帶來了很大的困難。研究[58]發現DNase1存在于HBV感染者血清的HBV顆粒中；在感染早期，HBV顆粒中存在的DNase1有助于降解循環中的HBV DNA顆粒，這也是感染早期HBV DNA顆粒復制較少的原因；隨著病程進展到肝硬化、肝癌階段時，DNase1的表達明顯上調，并且可以抑制HBV的復制。最近，Hallez等[42]發現DNase1可以與細胞內HBc簇結合，從而進入到新生的HBV衣殼中并降解HBV DNA，或可降低復發率，這為乙型肝炎的治療提供了新思路。

4 展望

DNase1是一種核酸內切酶，主要功能是降解人體內細胞死亡時釋放的DNA。DNase1中起主要作用的部位是DNase結構域，該結構域上的保守殘基通過催化作用影響核酸內切酶的活性。肝臟是DNase1的主要來源。目前發現DNase1與4種肝臟疾病有關：肝癌、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷和乙型肝炎。已有大量研究證實在肝臟疾病的發生發展過程中，DNase1發揮了阻止疾病進展的積極作用。但是目前關于DNase1的研究主要集中在其與自身免疫性疾病的關系，而關于DNase1在肝臟疾病發病機制中具體作用的研究還太少。進一步探索DNase1與肝臟疾病發生發展的關系，可為相關肝臟疾病提供新的生物標志物和治療靶點。