家族性腺瘤息肉病家系的APC基因突變篩查

林 銳，孔祥東，李曉麗

1)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院老年病科 鄭州 450052

家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)主要特征表現為結直腸布滿大小的腺瘤，息肉多于青少年期出現，少數在幼兒時期開始生長，嬰兒時期未見生長。息肉數量初起時不多，而后隨著年齡增長而增多[1-3]。FAP全球發病率為1/10 000～1/7 000，是一種高度外顯的常染色體顯性家族性腫瘤綜合征，外顯率近100%，具有易復發和易癌變的特征，常惡變為結直腸癌，與腺瘤性結腸息肉(adenomatouspolyposis coli,APC)基因突變有關[4]。APC基因的種系突變是導致FAP最常見的原因，APC基因定位于染色體5q21～5q22，含16個外顯子(其中第一外顯子不編碼)，編碼具有8個亞結構的APC蛋白。APC蛋白參與細胞周期的調控、凋亡、黏附遷移、信號轉導等過程，通過負性調控WNT/細連環蛋白通路抑制結直腸腫瘤發生[5-6]。第15外顯子突變最為多見，可長達6 574 bp，超過98%的突變是框移突變和無義突變，最終導致截短蛋白的產生。本研究采用高通量測序技術對4個FAP家系進行了突變篩查，報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2017年4月至2019年11月就診于鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心并進行基因檢測的4個FAP患者，男、女各2例，年齡29～35歲。所有患者進行直腸指檢、體格檢查，血常規、糞便隱血試驗、腫瘤標志物CEA及CA19-9檢測，CT/MRI影像學檢查，直腸鏡、電子結腸鏡+病理活檢均符合FAP診斷標準。依據《遺傳學結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》[7]，FAP的診斷標準：結直腸內彌漫性息肉數量≥100個或者腺瘤性息肉數量<100個并伴有家族史或者先天性視網膜色素上皮肥厚。從該院遺傳與產前診斷中心DNA庫中隨機挑選200名健康對照，對照均排除腫瘤及全身疾病。研究對象均簽署知情同意書，本研究獲得該院醫學倫理委員會批準(KS-2018-KY-36)。

1.2FAP基因突變檢測

1.2.1 基因組DNA提取 抽取患者外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，通過磁珠法提取試劑盒(美國Omega Bio-tek公司)和自動化DNA提取設備(艾本德中國有限公司)提取樣本DNA，采用超微量分光光度計(GE Healthcare公司)測定DNA的濃度和純度，DNA濃度均大于30 mg/L，A260 nm/280 nm達1.8～2.0。

1.2.2 高通量測序和數據分析 結直腸癌相關基因panel(包括MUTYH、BMPR1A、PTEN、POLE、BLM、GREM1、TP53、SMAD4、STK11、POLD1、EPCAM、MSH2、MSH6、CHEK2、MLH1、APC、PMS2、GALNT12)在Ion torrent PGM高通量測序平臺(美國Thermo Fisher Scientific公司)靶向擴增并進行文庫構建，制備模板并富集純化，加入測序引物和聚合酶后，在芯片上樣，通過Ion PGM擴二代測序(Sequencing 200 kit v2)試劑盒進行大規模平行測序。通過Ion Torrent Suite 4.0.2軟件處理分析高通量測序數據，用序列比對插件、coverage分析插件、varrentcaller插件進行進一步分析；在Ion reporter軟件上參考人類基因組版本hg19(https://ionreporter.1ifetechnologies.com/ir/)進行變異注釋。

1.2.3 Sanger測序驗證 參考Ensembl數據庫基因序列，應用Gene Tool軟件設計APC基因第15外顯子的引物，由上海生工生物有限公司合成(引物序列見表1)。純化PCR產物后采用ABI BigDye Terminator v3.1試劑盒測序，在ABI 3130XL 基因測序儀上進行直接雙向測序，最后用Chromas軟件分析測序數據，尋找變異位點。

表1 APC基因外顯子引物序列

1.3突變命名及致病性判定通過dbSNP、1000G、ExAC和PubMed等公共數據庫對目標變異位點進行檢索，未在人類基因變異數據庫(human gene mutation database,HGMD)專業版記錄中記錄同時也未被公共數據庫和學術論文報道過的變異可視為新變異。新突變的命名參考國際基因突變命名體制(http://www.hgvs.org/mutnomen)的命名法命名；參照美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南，評判突變位點的致病性。

2 結果

2.1臨床分析4個FAP家系中4名先證者的家系圖譜見圖1,臨床資料見表2。

□：正常表型男性；○：正常表型女性；■：男性患者；●：女性患者；箭頭所指為先證者

表2 FAP家系先證者一般情況

2.2FAP基因突變檢測結果家系1：先證者攜帶APC基因c.4348C>T(p.Arg1450Ter)[8]雜合變異，該變異為無義變異(圖2A)，導致APC蛋白翻譯提前終止，使APC蛋白含量減少或功能缺陷，HGMD專業版數據庫已報道其與FAP相關。結合先證者病史及家族腫瘤史，初步判定先證者的臨床表型為APC基因突變所致。

家系2：先證者攜帶APC基因c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)雜合變異(圖2B)，該變異在正常人群中的頻率為零，為低頻變異，未見相關致病性報道，為新發現突變，根據Mutation Taster軟件及ACMG指南，初步判定該變異為疑似致病變異。結合先證者病史及家族腫瘤史，初步判定先證者的臨床表型為APC基因突變所致。

家系3：先證者攜帶APC基因c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)[9]雜合變異(圖2C)，該變異為低頻變異，HGMD專業版數據庫已報道其與FAP相關，根據Mutation Taster軟件及ACMG指南，初步判定該變異為疑似致病變異。家系分析顯示，先證者母親因腸癌去世無法追蹤突變來源，先證者妹妹同樣攜帶該變異，先證者父親該位點無突變。結合該家系的家族史，推測已故先證者母親為該突變導致的腸癌患者的可能性極大。

家系4：先證者攜帶APC基因c.3594_3595delAA(p.Lys1199Glufs*8)雜合變異(圖2D)，該變異為低頻變異，未見相關致病性報道，為新發現突變，根據Mutation Taster軟件及ACMG指南，該變異初步判定為疑似致病變異。家系分析顯示，先證者父親攜帶該變異，先證者母親該位點無突變，符合常染色體顯性遺傳方式及突變-表型共分離規律。

A～D:分別為家系1～4

3 討論

腺瘤病理檢查和內鏡下結直腸息肉數目是目前臨床診斷FAP的主要依據，但某些消化道息肉疾病如Lynch綜合征、Peutz綜合征、MYH相關性息肉病、幼年性息肉綜合征、遺傳性非息肉性結腸直腸癌等與FAP難以區別，這使明確臨床診斷困難。因此，通過基因測序技術進行分子診斷可以輔助臨床及早準確地進行診斷和治療。本研究利用高通量測序技術對FAP家系進行了全外顯子組檢測分析，具有耗時短、成本低、數據量足等優點，檢測結果均經Sanger測序驗證。

有研究[9-10]報道西方人群中APC基因突變類型與臨床表型相關，突變密集區位于密碼子第1 027～1 354位，其中第1 061和1 309位密碼子的5 bp缺失是突變熱點，該突變導致的病變出現時間早、表型嚴重。第9外顯子、密碼子1～157位和1 595～2 843位的突變與輕型FAP相關(息肉小于100枚)[11]。本研究中，4例患者APC基因突變均發生在第15外顯子，與已有報道相同。

本研究中，4個家系檢出的APC基因分別為c.4348C>T(p.Arg1450Ter)、c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)、c.4384_4385delAA(p.Lys1462Glufs*6)、c.3594_3595del(p.S1198fs)4個變異，均是位于第15外顯子的無義突變和框移突變，均可導致終止密碼子提前出現編碼截短蛋白，截短蛋白的出現可造成β連環蛋白進入細胞核增多進而導致多種癌基因表達，其中c.3629_3630delAT(p.Met1211Valfs*5)和c.3594_3595del(p.S1198fs)變異均為未報道過的變異。

本研究不僅拓展了FAP致病基因變異譜，而且為理解該病的分子病理機制提供了重要信息，對該病的準確診斷、家系的遺傳咨詢具有指導意義。針對這樣的家系應詳細詢問家族史，當家族成員中有相似表型時，及時進行結腸鏡檢查同時結合基因檢測，及早監測攜帶突變而尚無臨床表型的家庭成員，以預防結直腸癌變。

隨著FAP臨床表型與APC基因相關性認知的深入研究和進展，臨床工作者可利用更先進的遺傳篩查技術更早、更準確地對患者進行診斷和治療，基因檢測結果可與臨床診斷相輔相成。此外，無家族史的FAP群體篩查也應受到重視，對于群體篩查，高通量測序也是一種適宜的技術。