眼底成像系統在視網膜色素上皮細胞黑色素檢查中的研究進展

袁 景，郭從容，馬菲妍,2*，尚慶麗，馬景學

(1.河北醫科大學第二醫院 眼科，河北 石家莊050000;2.深圳市新產業眼科新技術有限公司)

視網膜色素上皮(Retinal Pigmented Epithelium，RPE)細胞是位于視網膜光感受器底層的單層上皮細胞，其細胞膜具有選擇透過性。RPE細胞的主要功能是將營養物質和生長因子從脈絡膜毛細血管轉運至光感受器，起到血眼屏障的作用;吞噬視網膜代謝終產物、消化光感受器外節膜盤并生成新的膜盤，從而保證光感受器的正常功能;促進損傷后的再生和修復[1]。這些功能的異常可導致視網膜變性、光感受細胞死亡，最終導致視力喪失。RPE細胞中的黑色素對其周邊結構有重要的保護作用，它可吸納光感受細胞無法吸收的多余光，保護視網膜免受光產生的氧活性物質的影響。但RPE細胞中的黑色素不可再生，隨著光照、年齡等因素的影響逐漸累積，RPE則會表現出異常[2]。因此，對RPE細胞中的黑色素的定性定量檢測有助于提早發現視網膜相關病變。

1 基于LED光源的眼底成像系統

1.1 彩色眼底照相(Fundus Color Photography，CFP)

眼底照相是一種傳統的臨床成像方式，產生視網膜的二維、正面彩色圖像，大多數現代臺式眼底系統的視野約為 45°，不需要散瞳。眼底系統的基本組成部分是白光光源，照明路徑中有中央環形遮擋片、物鏡、變焦鏡頭，以及用于檢測圖像的攝像機。環形孔徑可在瞳孔處形成環形照明模式，在視網膜處形成環形照明模式，并在攝像機處檢測到圓形圖像。瞳孔處的環形照明模式減少了來自角膜的反向反射，并允許更好地檢測來自視網膜的反射光。照明和收集路徑可以與分光器或帶中心孔的鏡子結合，在傳輸收集光的同時使照明路徑偏轉[2]。

彩色眼底照相是臨床初步診斷中的基本檢查，部分疾病的臨床分級是依據眼底彩色照相進行的，例如年齡相關性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)，眼底照相中脫色素改變或色素堆積改變是其分級中的評估指標之一[3]。但彩色眼底照相的弊端是無法區分RPE細胞色素改變和脈絡膜色素改變，并且無法定量檢測。為了能夠定量檢測色素，在彩色眼底照相的基礎上發明出眼底反光測量儀。

1.2 眼底反光測量儀

眼底反射測定法基于視網膜光密度計測量(retinal densitometer)，該儀器由光源、改變入眼照射光波長的濾光片、可定量檢測視網膜反光的檢測器(光電倍增管)組成[4]。拍攝過程中先利用高強度白光漂白視網膜后，以較低光強的特定光譜(例如500 nm)進行二次照射，反射光的強度量化后可評估眼底色素的光密度強度。

眼底反光測量儀目前主要用于定量評估黃斑色素，包括視錐色素、視紫紅質和黑色素[5]。但眼底反光測量儀并未在臨床中推廣使用，主要原因是其測量計算模型復雜、結果的穩定性和一致性較差。導致結果穩定性和一致性較差的主要原因是由于屈光介質混濁以至于發生不同程度散射，以及不同層次組織的吸收程度變異較大。除此以外，眼底反光測量儀的結果輸出為數字，僅有少數模型可以形成二維平面圖，臨床解讀較困難，因此未能在臨床上推廣使用。

2 共聚焦掃描激光檢眼技術

掃描激光檢眼鏡(Scanning laser ophthalmoscopy,SLO)的出現為眼底熒光造影、自發熒光成像、廣角成像(wide-field SLO)、自適應光學SLO奠定了基礎。SLO最早由Webb 團隊報道于1981年，并隨后發展為共聚焦掃描激光檢眼技術[6]。其成像原理是在視網膜上投射低功率激光光束，以光柵(raster)方式對眼底進行掃描，具有成像快、分層掃描等優點，可以在非接觸情況下實現200°視網膜成像[7]。視網膜各個點位的反射信號可通過共焦針孔后被探測器記錄，生成二維圖像。離焦光束信號在成像過程中被抑制，因此，圖像的對比度得到增強、性噪比較優。這種對離焦光束的抑制程度隨著離焦的程度成比例，尤其是來自于晶狀體或角膜的信號源受到顯著信號抑制，所以可有效減少晶狀體和角膜干擾、降低光線在眼內的散射，成像清晰度高、對比度好[8]。SLO技術逐步融入其他技術模塊(如眼追蹤技術)，形成了高清眼底熒光造影、藍光自發熒光、近紅外自發熒光等組合成像方式。以下將從針對RPE細胞中色素成像角度進行梳理。

2.1 近紅外自發熒光(Near-infrared autofluorescence imaging,NIR-AF)

在2006年由世界氣象組織主辦的山洪預報國際研討會上，與會人員提出開發一套適合全球應用的山洪預警系統。目前，山洪預警系統（FFG system）正在通過一系列區域性項目在一些國家和地區推廣應用。已經實施的項目分布在中美、南非、黑海和中東等地區，一個原型系統已經自2011年在巴基斯坦開始運行。其應用的基礎數據是利用美國衛星可獲得的衛星降雨估算場、數字高程模型、遙感影像數據和地理信息系統。基于這些數據，可進行小流域基礎信息提取和降雨徑流分析計算。

眼底自發熒光(Autofluorescence，AF)是一種可以反映RPE代謝活力的檢測工具，它能顯示RPE細胞中脂褐質及發生在神經視網膜層下和外層視網膜疾病中的熒光團的分布情況。根據眼底發光體的不同，眼底自發熒光有幾種類型，目前已經研究明確的主要有兩種，即脂褐質相關藍光自發熒光(Fundus Autofluorescence，FAF)和黑色素相關NIR-AF，前者是依賴于RPE細胞中的脂褐質中的雙重類視色素(bisretinoids)的一種熒光形態，后者主要是來源于RPE層細胞中和脈絡膜層中的黑色素顆粒，Piccolino等人在1996年的一項研究中首次用捕捉到了視網膜中黑色素在近紅外光中的自發熒光信號[9]。NIR-AF近年來成為大家研究的熱點，該熒光的激發波長為795 nm，濾過波長為800 nm，其發射光經計算機處理數據后，可以將RPE細胞內黑色素的分布情況描繪出來，其受RPE層前自發熒光材料物質以及吸光度的影響，基于這些特性，NIR-AF是一種研究外層視網膜的很好的非侵入性的影像工具。

NIR-AF可用于AMD各期病變觀察，例如早期AMD地圖樣萎縮，也可用于視網膜變性疾病，包括視網膜色素變性、魚雷樣黃斑病變、Best卵黃樣黃斑病變、Stargardt 病、炎癥相關改變如一過性白點綜合征、Vogt-Koyanagi-Harada病等[10-11]。但NIR-AF明顯的弊端為軸向分辨率差，無法對色素的三維分布進行成像，RPE細胞的黑色素和脈絡膜黑色素無法分離、信號疊加，無法在不同患者的NIR-AF圖中實現色素濃度定量測量[12]。

2.2 熒光壽命成像(Fluorescence lifetime imaging ophthalmoscopy,FLIO)

熒光壽命定義為視網膜脈絡膜中自發熒光信號和熒光物質被激發后熒光信號持續的時間，熒光壽命測量反映的是分子受到光脈沖激發后返回基態之前在激發態平均停留的時間[13]。眼內黑色素家族是由真黑色素(Eumelanin)和嗜鎘黑色素(pheomelanin) 組成。真黑色素在棕眼人群中更普遍，嗜鎘黑色素在藍眼睛或綠眼睛人群中更多見。黑色素的熒光衰減較復雜，其熒光壽命短則持續數皮秒，長可持續至8納秒。細胞中的黑色素、脂褐素及黑色脂褐素顆粒具有十分活躍的自由基，被可見光或紫外線照射后易被激活，在氧化狀態下，黑色素的激發光為450 nm-470 nm，發射波長540 nm[14]。目前FLIO主要應用于激光眼底損傷、視網膜色素變性、中心性漿液性視網膜脈絡膜病變、Stargardts病等疾病的影像學輔助診斷[15]。

2.3 自適應光學掃描激光檢眼鏡(AdaptiveOptics，AO)

人眼內部存在像差，人眼像差的測量依賴于基于Hartmann-Shack原理設計的波前像差感測器，像差的測量結果可通過可變形鏡面進行校準，其中可變形鏡面由其背面大量推動桿(電子控制)進行調整，調整精度可達到2 μm。因此將波前像差校準技術與現有的光學成像技術相融后，即形成“自適應光學”。自適應光學成像可達到細胞水平的清晰度，且無創。自適應光學成像過程中，對于病變位置進行掃描，其反射光經過人眼屈光系統的折射發生方向偏移，進入波前像差感測器后反射光的偏移量可對可變形鏡面進行調整，并對人眼的像差進行屈光補償，此過程反復循環，直至眼球像差校正至近衍射極限水平，同時采用另外一個光源(非相干光)進行閃光拍照，并記錄在眼底照相或掃描機光檢眼鏡中[16]。

目前自適應光學可實現細胞水平成像，呈現色素上皮層的六角形結構，可直接觀察色素上皮細胞的形態，其原理決定其成像特點無法直接觀察色素改變，且其掃描效范圍較小(5°)、成像效率較低，故限制其臨床使用[17]。目前該技術已應用于AMD、Stargardt病、Vogt-Koyanagi-Harada病等眼底疾病的診斷[18-19]，均可呈現色素上皮細胞壁的微細結構改變，但其在提示RPE細胞色素改變中的價值需進一步探索。

3 光學相干斷層成像(Optical coherence tomography，OCT)

OCT首次出現于1996年，現已成為臨床診斷和隨訪的標準成像技術。OCT的工作原理是采用近紅外光掃描視網膜時，不同組織界面會產生不同的光反射強度和時間延遲，利用干涉測定儀測定近紅外光返回脈沖的延遲和強度變化的關系，由計算機系統對不同反射強度用不同的偽彩色進行標記和處理，形成高分辨率活體組織的OCT橫斷面圖像。光線先輸入一個光束分離器、一個樣品臂(如視網膜)和一個參考臂組成的干涉儀。結果干涉圖的傅里葉變換被用來獲得作為深度函數的OCT信號。因此，處理后的OC是一個復雜的信號，信號的幅度和相位都隨深度變化。單個OCT掃描(A-scan)是一個一維的測量樣品反射系數作為深度的函數。對樣品上的OCT光束進行光柵掃描，可以得到二維和三維的圖像。在偽彩色圖像中，最前面的紅色反射為視網膜神經纖維層(Retinal nerve fiber layer,RNFL)，以顳上和顳下最厚。此外,OCT還能分辨出視網膜的其他層次結構，在RNFL的下方依次為內外叢狀層(黃色反射)、光感受器細胞層(暗區)和色素上皮與脈絡膜毛細血管層(紅色反射)。通過計算機系統的進一步處理，可以得到各層次組織厚度等相關數據[20]。OCT典型的橫向分辨率可小至1.5 μm和9 μm，取決于物像和光源的波長。軸向分辨率由成像源的波長和帶寬決定，在一定程度上，較小的波長和較大的帶寬可以獲得更好的分辨率。眼OCT系統通常會集中在850-860 nm，50到100 nm帶寬,軸向分辨率3 μm和6 μm之間。利用這種組織對比機制和高軸向分辨率，可以在OCT圖像上分辨出不同的組織層，如神經纖維層、光感受器、RPE等。OCT中 RPE層表現為外層視網膜連續、完整的反光帶，但OCT圖像的主要對比對象是背景反光，無法針對色素特異的成像，也無法評估色素的功能性改變。因此為了更好地觀察RPE細胞色素，在OCT基礎上進一步發展出偏振敏感OCT和光熱OCT。

3.1 偏振敏感OCT (PS-OCT)

PS-OCT提供了樣品的雙折射信息，已被用于角膜和視網膜成像。要進行PS-OCT，入射的OCT光必須循環極化。通過樣品后，樣品組成決定了發出的光可保持橢球偏振模式。單個探測器被用來測量極化光的垂直和水平分量。采用不同的算法提取樣品的偏振特性，然后將其映射到深度分辨的OCT強度圖像上[21]。有人利用黑色素在RPE中探測到PS-OCT信號的來源，發現極化均勻度與黑色素濃度相關，這一結果后來在大鼠身上得到證實[21]。然而，這種關系強烈依賴于樣本的顆粒分散特性，即黑色素顆粒的大小和形狀。PS-OCT已被用于從2D或3D OCT數據集中采集到AMD、RPE脫離和假卵黃樣營養不良的患者的RPE形態，并可用于計算視網膜或脈絡膜厚度。

3.2 光熱OCT (PT-OCT)

PT-OCT是另一種功能性OCT技術。PT-OCT可檢測組織中的光學吸收物，其分辨率和成像深度與OCT類似，利用了光熱效應，即對比劑(如黑色素)吸收的光子以熱的形式重新發射。為了進行PT-OCT，將調幅激光器與相敏OCT系統相結合，該附加激光器的波長與造影劑的吸收峰相對應。光子吸收后的溫度升高會導致吸收器周圍的熱彈性膨脹，并改變組織的折射率。它被檢測為OCT相位信號的變化，且PT-OCT信號強度與組織的吸收系數成正比[22-23]。PT-OCT首先在眼睛中進行，在色素小鼠的RPE中檢測到黑色素信號，對照組白化小鼠中沒有相應信號[24]。后續研究是在斑馬魚中進行的，斑馬魚每只眼睛的RPE中都有色素和非色素區域[25]，PT-OCT信號對斑馬魚眼黑色素具有特異性。PT-OCT還通過比較適應黑暗和適應光的野生型斑馬魚，檢測了RPE內的黑素體遷移。

PS-OCT和PT-OCT都被認為是功能性OCT技術。它們能產生像OCT這樣的高分辨率圖像，而且都能獲得視網膜的體積圖像，這些圖像與OCT強度圖像完美地重合。無論是PS-OCT還是PT-OCT儀器，都可以與OCT血管造影等其他方式相結合進行多模態成像。

4 多光譜眼底分層成像(multi spectral fundus imaging system，MSI)

光譜學(Spectroscopy)是研究物體對光的反射特性的學科，通過測量特定光譜的反射強度提示物質的特定組成(光譜指紋)，其在生物醫學領域亦稱光譜成像(spectral imaging)，可用于分析光譜物質的空間分布。在眼科領域，目前應用技術有兩種，多光譜技術(Multispectral Imaging)和高光譜技術(Hyperspectral Imaging)。光譜技術有兩方面應用，第一是眼底病灶的物質組成分析，例如MSI；第二是通過不同光譜的圖像信息對比，進行眼底血氧代謝分析。后者暫不在本文中討論。

多光譜一般采用5-10個光譜波段，波段寬度為5-10 nm，為非連續光譜；高光譜一般采用光譜較密集，可達到100個或以上掃描波普，波段寬度2-3 nm。光譜可包含可見光、紅外光，短波長在眼內組織內穿透能力較弱，達到眼底淺層組織即發生反射和散射，主要對淺層組織進行成像，而中波長即近紅外波長穿透力強，可達到外層視網膜、RPE和脈絡膜層。MSI是使用不同的光波長度的發光二極管(LED)改進技術，范圍從550納米(綠色)到850納米(紅外線)，以檢查視網膜層和脈絡膜。機器中的圖像形成取決于入射光的波長和反射光的波長。因為在視網膜的不同層和不同組織在相同層中的顏色不同，MSI可以顯示從視網膜到脈絡膜清晰的視野。MSI在臨床上多用于糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)、息肉樣脈絡膜血管病、視網膜靜脈阻塞等疾病的檢查診斷[26]。MSI在PRE色素病變中的應用包括：AMD相關色素上皮改變的形態學觀察[27]、nv-AMD中RPE的觀察、VKH色素改變、脈絡膜腫瘤對色素上皮變化的觀察等[28]。其主要弊端為基于LED系統的光譜照相系統容易受到晶狀體散射的影響，影響圖像質量。由于目前MSI圖像無法精準分層，需要結合SLO或OCT成像系統對成像平面精準定位。

5 總結

近年來，隨著電子設備和成像技術的完善和創新，視網膜色素眼底成像，從傳統的彩色眼底照相發展到現如今的光學相干斷層成像、多光譜成像等先進成像技術，為廣大眼底疾病發展進程中的各種形態學特征改變提供了極大的幫助，不過現有的成像技術也依然存在各種各樣的短板和局限性。

彩色眼底照相可進行初步色素的定性分析，眼底反射測定法雖然可以定量檢測RPE細胞中的黑色素，但分析模型復雜，因此難以在實踐中實施；NIR-AF易于臨床解讀，但很難將脈絡膜黑色素和RPE細胞黑色素分離；AO可呈現色素上皮層的六角形結構，能直接觀察色素上皮細胞的形態，但無法直接觀察色素改變，且其掃描效范圍較小(5°)、成像效率較低；OCT能分辨出不同的組織層，如神經纖維層、光感受器、RPE等，但無法針對色素特異成像，也無法評估色素的功能性改變；多光譜眼底成像和高光譜眼底成像可利用窄光譜成像技術，對視網膜脈絡膜進行多層成像，也可單獨提取色素上皮信息相對豐富的層次，但尚未實現精準分層。

不同眼底成像系統從不同角度呈現RPE細胞中的黑色素分布和形態變化，為臨床提供多種診斷信息，有利于疾病的綜合分析和判斷。