熒光染色鏡檢法與KOH濕片鏡檢法在皮膚淺部真菌感染診斷中的應用

趙 野，姜日花，朱明姬,蓋保東，王 珂

(吉林大學中日聯誼醫院 1.皮膚科;2.胃腸結直腸肛門外科;3.產科，吉林 長春130033)

淺部真菌病是一種皮膚科常見病，近年來，隨著腫瘤、艾滋病等免疫功能受損患者的增多，以及抗菌類藥物濫用，真菌感染發病率呈上升趨勢。侵襲性真菌感染(IFD)是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-2]。目前臨床診斷中真菌感染最常用檢查辦法是真菌鏡檢及真菌培養，KOH濕片法是門診真菌鏡檢常用的方法，真菌培養法也是公認的診斷真菌病的金標準，但這兩種檢查方法均易被標本、檢查技師水平等因素干擾，導致兩者的假陽性及假陰性增加，兩種檢查方法準確率甚至可低至15%[3]。

近年來出現了熒光染色法檢查真菌感染疾病，在肺曲菌病的既往研究中體現了熒光染色法的快捷、敏感、準確性高等優點[4-5]。其機理是由于熒光染色劑特異性結合真菌細胞壁的幾丁質，標記真菌菌體，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲和孢子呈亮藍色或亮綠色的熒光，結構清晰，可輕易與背景和雜質相鑒別。現將吉林大學中日聯誼醫院門診疑診淺部真菌感染的患者作為研究對象，以期探討在淺部真菌感染診斷中熒光染色法的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年1月-2020年6月期間吉林大學中日聯誼醫院皮膚科門診就診患者中疑診為淺部真菌感染的450例患者，其中手足癬198例、體股癬167例、甲癬54例、頭癬31例;在病損部位采集皮屑、甲屑、斷發、發根等作為檢驗標本。選取的所有患者均未接受抗真菌治療。

1.2 試劑與儀器

試劑與儀器：熒光染色液(江蘇萊芙時代生物有限公司)；10% KOH溶液(自行配置)；奧林巴斯BX41熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3 方法

1.3.1取材 所有皮損部位均先應用75%乙醇消毒，然后應用一次性手術刀刮取疑診部位的皮屑、甲屑、斷發標本，將取材標本均分為兩等份，分別進行熒光染色體以及KOH濕片鏡檢。以上操作均由2名醫師完成，結果一致記錄為檢驗合格。

1.3.2KOH濕片鏡檢法 取適量取材樣本置于載玻片上，加1滴10%KOH溶液，覆蓋蓋玻片。將載玻片在酒精燈火焰上快速通過2-3次進行加熱，避免溶液沸騰造成結晶形成，之后輕壓蓋玻片，擠壓標本，排出氣泡，在顯微鏡下進行鏡檢。

1.3.3熒光染色法 載玻片上取適量樣本后加入1滴熒光染色液，覆蓋并輕壓蓋玻片，排出氣泡，在顯微鏡下進行鏡檢。

1.4 統計學分析本組研究采用SPSS 22.0軟件進行數據分析和處理，其中，計數資料以例(率)形式表示，采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡下表現

KOH濕片法在顯微鏡下背景雜亂，真菌菌絲及孢子與背景差異較小，無明顯顏色區別，不易辨別；熒光染色法鏡下觀察背景及雜質呈暗黑色，而真菌孢子及菌絲呈亮藍色，真菌輪廓清晰與周圍環境差異明顯，容易辨別。

2.2 疑診淺部真菌感染應用兩種鏡檢法的陽性率比較

熒光染色法與KOH濕片法陽性率比較兩種方法的總陽性率分別為276例(61.33%)、193例(42.89%)，差異有統計學意義(χ2=30.67，P<0.05)。見表1。

表1 兩種方法在各種淺部真菌病鏡檢結果比較

3 討論

淺部真菌病是一種常見的感染性皮膚病，多因真菌侵犯人體體表組織如皮膚、指(趾)甲、毛發等所致，根據發病部位不同可分為體股癬、手足癬、甲癬、頭癬等各類癬病，皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌等是引發該病常見的真菌[6]。

KOH濕片法是目前國內最常用的真菌鏡檢方法，也是真菌感染性皮膚病與其他疾病鑒別的重要手段之一，也是因其操作簡便，成本低廉，已在臨床檢驗中普遍應用[7-8]。但KOH濕片鏡檢法也有不足之處：背景環境雜亂，標本未經染色，真菌與樣本顏色一致，因為細胞壁、纖維及小氣泡、脂滴的存在導致難以凸顯真菌菌絲及孢子結構，如患者既往不規律涂抹藥物、樣本中菌絲或孢子量較低時，極易造成漏檢，往往需要經驗豐富的檢驗技師，才能提高直接鏡檢的準確率。

熒光染色法采用酶聯染色法，染色液主要成分包括高純度的熒光素和特定比例的KOH溶液，熒光素標記的幾丁質酶能快速識別并特異性的結合真菌細胞壁中的幾丁質，形成強熒光復合物，在紫外光作用下，使真菌結構呈亮藍色熒光，熒光染色劑并不標記脂滴，故脂滴與孢子容易分辨。真菌標本中的纖維素也可被熒光染色法標記，在熒光顯微鏡下也可發出亮藍色熒光，但纖維素并沒有真菌典型的菌絲橫隔和出芽現象，可明確辨別，減少了假陽性結果[9-12]。鏡下菌絲形態結構清楚易辨，清晰，反差大，孢子 染 色 后 結 構 清 晰，易 于 分辨，大大提高真菌檢出陽性率，且顯著縮短真菌鏡檢時間。熒光染色法容易掌握，滴加染液后無需加熱，角質溶解快于KOH濕片法，鏡下背景干凈，真菌形態清晰顯著，易于觀察，降低了疑難標本(如菌絲量少、角質過厚、僅有孢子、或外涂藥膏)直接鏡檢的假陽性率，提高準確率，其缺點主要在于試劑成本略高。

本研究將門診收集的450例疑診淺部真菌感染患者的標本分別進行熒光染色法和KOH濕片法精簡檢查，通過比較兩者的檢出陽性率，結果表明熒光染色法的檢出陽性率(61.33%)明顯高于KOH濕片法(42.89%)；且不同來源的標本(皮屑、甲屑、毛發)采用熒光染色法檢出陽性率也高于KOH濕片法。

綜上所述，熒光染色法和KOH濕片法兩種方法對于皮膚淺表真菌感染的診斷均有積極意義，具有操作簡單的特性；但熒光染色法的檢出陽性率更高，為臨床疑診真菌感染患者提供更加快捷、準確的檢查方法，在直接鏡檢的臨床應用中具有更好的推廣價值。