“亞洲型”DEL血型檢測方法的比較研究

楊 帆,韓 瑜,聶婷婷,劉玲玲,于江虹,焦立新,陳 琳

(吉林省血液中心，吉林 長春130033)

Rh血型系統(tǒng)中，D抗原免疫原性最強(qiáng)，大多數(shù)的Rh陰性個(gè)體，通過輸血或妊娠，可受D抗原陽性紅細(xì)胞免疫而產(chǎn)生抗D。Rh血型D抗原(RhD)陰性女性懷孕時(shí)胎兒會面臨新生兒溶血病風(fēng)險(xiǎn)，所以常進(jìn)行抗體篩查檢測和抗D免疫球蛋白注射。但最新研究表明：中國RhD初篩陰性人群中，約17%-30%為“亞洲型”DEL血型，其分子遺傳背景為RHD*1227A基因型，該血型紅細(xì)胞表面表達(dá)完整的RhD抗原，懷孕婦女在RhD陽性胎兒的免疫刺激下不產(chǎn)生抗D，因此不需進(jìn)行過于頻密的抗體篩查檢測和抗D免疫球蛋白注射。可是DEL血型檢測并未常規(guī)應(yīng)用于臨床，造成該血型孕婦長期被作為RhD陰性對待。本研究通過對傳統(tǒng)血型血清法(吸收放散法)與分子生物學(xué)法(熒光PCR法、PCR-SSP法和熔解曲線分析法)對“亞洲型”DEL血型檢測，對RHD*1227A基因型檢出率進(jìn)行比較及一致性分析，為實(shí)驗(yàn)室及臨床提供合理選擇“亞洲型”血型檢測方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源本血液中心357例經(jīng)鑒定為RhD陰性的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，經(jīng)過對DEL血型高度關(guān)聯(lián)的C抗原[1]篩選，90例陽性標(biāo)本用于檢測“亞洲型”DEL血型。

1.2 儀器與試劑快速自動(dòng)編程PCR儀(BIO-RAD)、熒光定量PCR 儀(ABI 7500，美國)、單克隆抗體IgG抗-D(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)、單克隆抗體IgG+IgM(加拿大，IMMUCOR)、IgG+IgM(英國，MILLIPORE)；微柱凝膠抗人球卡(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、樣本釋放劑試劑盒(廣州展全生物科技有限公司)、DNA提取試劑盒(康為世紀(jì))、紅細(xì)胞RHD基因分型檢測試劑盒(江蘇偉禾生物科技有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1血型血清學(xué)試驗(yàn) 待確認(rèn)紅細(xì)胞洗滌3遍后配制成濃度為0.8%-1%的紅細(xì)胞懸液加入微柱凝膠抗人球卡3孔，分別加入3種抗-D試劑(單克隆IgG及IgM+IgG)，37℃孵育15 min后離心。對應(yīng)血漿加入抗篩細(xì)胞，采用凝膠卡法進(jìn)行抗體篩查。確認(rèn)RhD陰性的紅細(xì)胞1滴加入試劑抗-C，結(jié)果為陽性的樣本進(jìn)行下一步“亞洲型”DEL血型檢測。

1.3.2DNA提取 嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說明書步驟操作，濃度介于15-40 ng/μl，A260/A280介于1.6-2.0之間。

1.3.3吸收放散法 參照文獻(xiàn)報(bào)道[2]及試劑盒說明書步驟及方法進(jìn)行。

1.3.4熒光PCR法 按照人類紅細(xì)胞RHD基因分型檢測試劑盒說明書步驟操作及結(jié)果分析判讀。熒光PCR擴(kuò)增檢測條件：95℃ 2 min 30 s；94℃ 15 s、65℃(信號采集點(diǎn))55 s，35個(gè)循環(huán)。

1.3.5PCR-SSP法 文獻(xiàn)報(bào)道[3]針對中國漢族人群最常見“亞洲型”DEL血型等位基因RHD*01EL.01(即RHD*1227A基因型)引物序列，同時(shí)使用陰、陽對照進(jìn)行PCR-SSP試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min,接著94℃30 s,62℃30 s，72℃15 s，35次，72℃5 min之后，4℃退火延伸。

1.3.6熔解曲線分析法 按照文獻(xiàn)報(bào)道[4]對標(biāo)本進(jìn)行熔解曲線分析,反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 15 s;60℃ 1 min，以0.2℃/s 的升溫速度升溫至95℃，收集此溫度范圍內(nèi)的熒光信號。熔解曲線分析程序結(jié)束后，自動(dòng)生成1個(gè)熔解曲線。結(jié)果使用ABI 7500系統(tǒng)自帶的溶解曲線分析程序進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同方法檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kappa值在0.41-0.60為中度的一致性；Kappa值在0.61-0.80為高度一致性。

2 結(jié)果

2.1 4種檢測方法檢出率比較

見表1。

表1 4種檢測方法檢出率比較

組間比較，χ2值為1.275，P>0.05結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 4種檢測方法一致性比較

見圖1。

圖1 4種檢測方法一致性比較

3 討論

DEL表型在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)于東亞，是一種具有很微弱D抗原的血型[5]。中國人群中超過95%的DEL血型個(gè)體的分子遺傳背景為RHD*01EL.01等位基因(即RHD*1227A)。以往常用傳統(tǒng)血型血清學(xué)的吸收放散法進(jìn)行檢測，但是操作復(fù)雜且周期長，隨著分子生物學(xué)法發(fā)展，有文獻(xiàn)報(bào)道采用PCR-SSP法和熔解曲線分析法檢測DEL血型[3-4]，新近又出現(xiàn)了熒光PCR法。本研究對這幾種檢測方法進(jìn)行比較，并分析操作的影響因素。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明4種檢測方法結(jié)果檢出率(P>0.05)無顯著性差異,傳統(tǒng)吸收放散法檢出率最高，但是經(jīng)過后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存在個(gè)別假陽性情況。與吸收放散法比較，檢測結(jié)果一致性從高到低分別為熒光PCR法、熔解曲線分析法、PCR-SSP法。

經(jīng)過對比我們總結(jié)如下：吸收放散法優(yōu)點(diǎn)是試劑價(jià)格便宜，需要設(shè)備簡單，適合基層單位開展，但是操作過程中要掌握好細(xì)節(jié)提高準(zhǔn)確性，細(xì)胞要多次洗滌徹底，酸放散過程需嚴(yán)格把控反應(yīng)時(shí)間及離心時(shí)間，注意中和顯色度，避免中和時(shí)間過長，影響結(jié)果；熒光PCR法優(yōu)點(diǎn)是特異性好，結(jié)果好判定且耗時(shí)短，但是試劑費(fèi)用大，實(shí)驗(yàn)中需注意保證反應(yīng)板及蓋板膜的潔凈，以免造成熒光污染；熔解曲線分析法優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低，實(shí)驗(yàn)人員要有一定分子生物學(xué)經(jīng)驗(yàn)，判讀結(jié)果時(shí)，按照Tm值(熔解溫度)區(qū)分不同等位基因。PCR-SSP法由于成本低及操作便利得到廣泛應(yīng)用，但是由于人員操作、試劑質(zhì)量、設(shè)備狀態(tài)等原因容易出現(xiàn)非特異性條帶或擴(kuò)增失敗，導(dǎo)致假陰性或假陽性，影響結(jié)果判讀。

綜上所述，通過幾種“亞洲型”DEL血型檢測方法的比較分析，了解各自優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自身?xiàng)l件選擇準(zhǔn)確、合理的檢測方案。