干細胞外泌體在阿爾茨海默病發病機制中的作用

曾琳琳，付學奇

(吉林大學生命科學學院 Edmond Fischer細胞信號傳導實驗室，吉林 長春130012)

1 細胞凋亡在阿爾茨海默病(AD)中的作用

AD是一種常見的神經系統退行性疾病，其病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積，Tau蛋白高度磷酸化形成的神經纖維纏結(NFTs)，以及大量神經元死亡導致大腦功能調控紊亂，從而出現嚴重的記憶認知障礙[1]。由于AD的具體發病機制尚不明確，目前臨床上并沒有成熟有效的治療手段或者藥物。

近年來，阻斷神經元大量凋亡已經成為緩解AD的重要方向和手段。Aβ蛋白沉積可引起氧化應激、Ca2+通道受損，進而破壞線粒體，激活線粒體內源性細胞信號傳導通路，誘導神經細胞凋亡。Aβ還能夠調控凋亡相關基因Bcl-2家族蛋白表達，其中促凋亡基因Bim表達升高，抗凋亡基因Bcl-xl表達降低。

AD分為家族性AD(fAD)或散發性AD(sAD)，fAD主要表現為3種基因的突變：Aβ前體蛋白(APP)、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)，每種基因都編碼各自的蛋白質[2]。其中APP可以與死亡受體6(DR6)相互作用，并通過激活DR6，調節腫瘤轉移分子機制[3-5]。PS1與PS2均與細胞凋亡密切相關，PS1可以通過γ-分泌酶活性及與Presenilin1相關蛋白PSAP(Presenlin1-associated protein)相互作用兩條途徑誘導細胞凋亡的發生，而線粒體特異性蛋白PSAP在DR6誘導的細胞凋亡中扮演著重要的角色[6]。由此可見，細胞凋亡在AD發病機制中發揮著重要的作用，阻斷神經元大量凋亡是未來預防及治療AD的重要思路與策略之一。

2 干細胞概述

近年來，干細胞治療為神經系統退行性疾病的臨床治療帶來了希望，干細胞具有自我更新并且在腦組織中分化為神經細胞的能力，可以通過神經營養因子恢復神經可塑性和神經發生[7]。根據分化為不同細胞類型，干細胞可分為4種：神經干細胞(NSCs)、間充質干細胞(MSCs)、胚胎干細胞(ESCs)和誘導多能干細胞(iPSCs)[8]。這些干細胞都具有不同的特征，可以以不同方式在不同疾病中參與治療。間充質干細胞因其易于分離及體外培養，而且免疫原性低，不涉及倫理問題，是近年來研究較多的干細胞之一。

MSCs來源廣泛，可存在骨髓、脂肪組織、肺、肝和臍帶等多種組織[9]，并具有分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和胰島等潛能[10]。骨髓間充質干細胞(BMMSCs)能夠參與免疫系統紊亂和由免疫因子介導的神經退行性疾病，包括IL-1、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子-inhibitor[11-14]。MSCs通過Wnt通路體外介導增加海馬區神經再生和分化[15]，而將人臍血間充質干細胞移植到AD小鼠模型的側腦室或海馬區內，可阻斷Aβ42的沉積及神經元的變性退化，從而改善記憶認知能力[16-17]。不僅如此，大鼠脂肪源性干細胞(ADSCs)也發現能夠誘導分化為神經元細胞，改善AD動物模型認知障礙，提高學習記憶能力[18]。盡管MSCs治療是一種很有前途的治療手段，但在應用中都存在著各種各樣的缺陷。比如骨髓來源的間充質干細胞，提取和培養困難，限制了其在臨床試驗中的應用。很多MSCs也存在排斥反應、靶向性和歸巢性差等局限性。然而，研究報道MSCs也可分泌多種生物因子，比如神經營養因子、血管生成因子等促進神經再生，保護軸突退化變性，誘導血管生成等，從而在神經系統退行性疾病中發揮作用。

3 外泌體(exosomes)的生物學作用

大量研究指出細胞外囊泡(EVs)在細胞生物學功能與疾病發生中發揮著重要的作用，其中，外泌體是細胞在不同生理條件下釋放到細胞外基質的一類直徑約40-200 nm的微小囊泡。外泌體在細胞發育、免疫應答、腫瘤發生等生物學過程中研究比較廣泛[19-20]。

MSC-EVs能夠參與抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。據報道，MSC-EVs將miR-133b轉移至膠質瘤細胞中，通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路來潛在抑制EZH2的表達，從而抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移[21]。hU-MSCs-EVs通過降低Bim、Bad、Bax蛋白水平，抑制caspase-3和caspase-9活化，有效提高大鼠腎小管上皮細胞NRK細胞存活率，從而抑制細胞凋亡，控制順鉑腎毒性，提高順鉑的臨床治療效果[22]。

從角膜基質干細胞(CSSC)中提取的間充質干細胞能預防小鼠角膜損傷后纖維化瘢痕形成，促進透明基質組織再生。來自CSSC的EVs與活細胞同樣有效地減少了小鼠角膜傷口的視覺疤痕，說明了細胞外囊泡在CSSC細胞阻斷瘢痕形成和啟動角膜透明組織再生過程中有重要作用[23]。

MSCs分泌的外泌體對于許多疾病有治療前景，將周細胞的外泌體移植至脊髓損傷小鼠可恢復其運動功能，因為周細胞的外泌體可以減少病變，改善運動功能，改善血液循環，修復脊髓損傷產生的缺陷。此外，外泌體還可以改善內皮細胞的功能，調節血流，減輕水腫，HIF-1a、Bax、Aquaporin-4和MMP2表達下降而Claudin-5、Bcl-2表達上升，抑制細胞凋亡。同時還與PTEN/AKT通路密切相關，提示周細胞外泌體對脊髓損傷有治療前景[24]。

4 外泌體在AD中的作用

AD是最常見的神經退行性疾病，可導致學習和記憶障礙。來源于MSCs的細胞外囊泡可以作為一種替代性的治療手段。MSC-EV不僅具有傳遞脂類/蛋白質/酶/microRNAs的能力，而且能夠抗炎、促進Aβ降解和維持神經活性，因此可以修復突觸功能，阻斷神經元的死亡，并減緩AD患者的記憶障礙[25]。AD的病理特征源于腦內Aβ的不平衡穩態。研究發現，從AD患者腦脊液和血漿、AD小鼠模型的血漿樣品以及表達PS1突變體的神經細胞培養基中分離出的EVs，能破壞神經元的Ca2+穩態，損害線粒體功能，并使神經元對細胞毒性更加敏感。EVs中Aβ含量相對不高，但Aβ42/Aβ40比值有所增加；Aβ大部分位于EVs表面。溶酶體功能受損導致EVs的生成增加，Aβ42表達水平升高。EVs可介導致病性Aβ的跨細胞傳播，損害神經元的Ca2+代謝和線粒體功能，從而使神經元易受細胞毒性的影響[26]。

雖然體外實驗證明，由AD神經元生成的EVs具有神經毒性，但對AD-EVs在體內的作用機制知之甚少。微管相關蛋白tau的高度磷酸化在fAD相關神經變性中也發揮關鍵作用，表明Tau蛋白可通過EVs的傳遞在AD大腦中產生影響。文獻報道[27]一名攜帶PS1A246E突變的fAD患者來源的iPSC-神經元培養基分離出EVs，注射至野生型C57BL/6小鼠的海馬區中，5周后，對小鼠實施安樂死并進行病理學評估，與對照組相比，注射fAD-EVs的小鼠在多個部位顯示tau蛋白磷酸化增加。此外，fAD-EV注射的海馬CA1區tau內含物明顯多于對照組。這些研究結果均表明，EVs能夠介導fAD相關的tau功能改變，為將來研究EV靶向治療fAD的臨床治療和藥物開發提供了理論依據和科學基礎。

Bieberich課題組的實驗結果不僅說明外泌體與AD中Aβ的聚集和tau蛋白傳播擴散有關，而且，在進一步的實驗中，中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)在神經細胞中的抑制或沉默可以阻斷外泌體的形成。有研究構建了nSMase2基因缺失的AD小鼠，通過體外和體內實驗檢測Aβ42的生成及聚集，體外實驗結果發現抑制了Aβ42對膠質細胞清除的能力，并證明了富含神經酰胺的外泌體能夠參與斑塊的形成。與普通AD小鼠相比，nSMase2基因缺失的AD小鼠在恐懼條件下的學習任務中降低了腦外泌體生成、神經酰胺水平及血清抗氧化IgG含量，調節膠質細胞激活、Aβ42聚集、tau磷酸化水平，改善了認知能力[28]。

Micci等人研究了海馬神經干細胞分泌的外泌體促進突觸對Aβ寡聚體(Aβo)彈性的影響，實驗從海馬神經干細胞(NSC-exo)或成熟海馬神經元(MN-exo)培養基中分離的外泌體，在評估Aβο誘導的海馬長時程增強(LTP)和記憶缺陷的抑制前，將其注射入側腦室(ICV)，結果表明，NSC-exo而不是MN-exo，可以消除Aβo誘導的LTP抑制的記憶缺陷，還顯著降低Aβo與突觸的結合。同時，內源性NSC-exo的轉基因切除增加了突觸與Aβo結合，而外源性NSC-exo抑制了這種結合。這些結果揭示了一種新的機制，將NSC-exo和突觸對Aβo的易感性聯系起來[29]。

減少Aβ的積聚是治療AD的一種主要方法，在AD治療中，來自不同尺寸支架細胞的外泌體是否能減少Aβ沉積或改善認知功能下降至關重要。文獻報道以三維石墨烯支架和二維石墨烯薄膜為基質，進行人臍帶間充質干細胞培養，從中提取上清液分離外泌體。3D培養的外泌體(3D-Exo)中195種miRNA和蛋白質(包括neprilysin、胰島素降解酶和熱休克蛋白70)的水平與2D培養的差異顯著。因此，3D-Exo可以通過其特殊的載體上調AD病理細胞和轉基因小鼠α-分泌酶的表達，下調β-分泌酶，從而降低Aβ的產生，對改善AD小鼠的記憶和認知功能障礙具有增強的治療作用。這些發現為干細胞來源的支架材料和功能性外泌體提供了新的臨床應用[30]。

ADSC在治療AD等神經退行性疾病方面也具有潛在的治療前景，許多研究表明，Aβ通過神經元細胞的線粒體功能障礙在AD的進展中起著關鍵作用。以TG2576 AD小鼠腦NSCs為材料，研究ADSC外泌體(ADSC-Exo)對AD表型的影響。結果顯示，ADSC-Exo處理可降低AD細胞的Aβ42、Aβ40水平和Aβ42/40比值。ADSC-Exo處理使p53、Bax、裂解的caspase-3增加，Bcl-2蛋白水平降低，從而抑制AD神經元細胞凋亡。此外，AD患者大腦中被Aβ損傷的軸突生長通過ADSC-Exo治療得到增強。綜上所述，這些發現提示ADSC-Exo在轉基因小鼠AD體外模型中具有調節疾病的作用，ADSC-Exo可以作為改善Aβ誘導的神經元死亡和AD進展的治療源[31]。

5 展望與總結

包括MSCs在內的干細胞對于神經系統退行性疾病的臨床應用目前已經得到廣泛的認可，但是干細胞治療依然存在很多問題和風險。近年來，MSCs可通過分泌外泌體參與血管生成、神經元胞體退化，神經軸突變性，神經保護等過程，從而治療神經退行性疾病。與MSCs相比，外泌體優勢明顯，結構穩定、體積小，生物相容性較好，可以通過血腦屏障，是治療神經系統退行性疾病的理想藥物載體。但是，外泌體成分復雜，MSCs-EV可分泌多種因子，包括神經營養因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子等，不同細胞來源的外泌體的內容物不盡相同，生物學功能也存在差異。總而言之，外泌體廣泛應用于臨床治療，或者作為載體用于藥物開發，尤其針對于神經系統疾病，仍然處于起步階段。還需要對外泌體相關分子機制進行深入的研究，明確不同來源外泌體的內含物、分泌物以及與細胞間的信號傳導，不同條件下對外泌體的調控以及其與靶蛋白的相互作用。隨著神經退行性疾病的研究不斷深入，外泌體在臨床應用中的重要作用也會逐漸顯現，在臨床應用及藥物開發中具有廣泛前景。