中藥材種子種苗真實性鑒定技術研究進展△

趙莎，鄭司浩，曾燕，戴瑋，李鵬英，王繼永

中國中藥有限公司，北京 100195

中藥材種子種苗是中藥材生產的物質基礎，是中藥大健康全產業鏈的起點，也是《中共中央國務院關于促進中醫藥傳承創新發展的意見》中“加強中藥材質量控制”的關鍵點。當前，市場上中藥材種子種苗質量參差不齊，存在種源混雜、以假充真等問題[1]，特別是野生資源緊缺、市場價值高的中藥材品種，已成為種子種苗摻偽的重災區[2]。因部分中藥材種子體積較小、肉眼難以分辨、正品及其混偽品外觀性狀相似等原因，導致中藥材種子種苗真實性鑒定難度增加。另外，因從業者對中藥材種子種苗真實性鑒定不夠重視或缺乏專業的鑒定知識，容易造成鑒定錯誤。一旦種子種苗真實性鑒定錯誤，將給藥農帶來不可彌補的經濟損失，給臨床用藥安全帶來隱患。中藥材種子種苗真實性鑒定錯誤已是中藥材市場混亂的重要原因[2]。例如，柴胡資源在我國分布廣泛，市售柴胡種子存在品種多樣、來源不確定和質量不穩定等問題，極不利于“有效、優質、穩定、可控”的柴胡藥材生產[3]。陳美君[4]發現，從農戶、小型種植基地或白及種苗公司采集的白及樣品為黃花白及或小白及，可見白及藥材在栽培種植源頭就已出現基原混亂的現象。因此，保證中藥材種子種苗基原準確對把控好中藥材生產的源頭至關重要。

1 中藥材種子種苗真實性鑒定技術

種子真實性是指一批種子的特性，供檢品種與文件記錄（如標簽等）是否相符，即品種是否名副其實[5]。種子真實性是衡量種子質量的重要指標之一。目前，中藥材種子種苗真實性鑒定方法主要有性狀鑒定、顯微鑒定、理化分析鑒定、分子鑒定等。

1.1 性狀鑒定

性狀鑒定包括傳統性狀鑒定及微性狀鑒定。傳統性狀鑒定主要是通過觀察中藥材種子形狀、大小、顏色、表面紋理等典型特征進行鑒定；微性狀鑒定是通過觀察中藥材種子表面的細微特征，根據表面反映出的不同信息特征達到鑒定中藥材種子的目的[6-7]。后者與前者沒有本質的區別，是前者向著微觀領域的延伸。

1.1.1 傳統性狀鑒定 由于不同物種遺傳基礎不同，種子形態和內部結構常呈現穩定的差異，通過對這種穩定的差異（如種子的形狀、大小、顏色、種皮表面紋飾）進行觀察統計可區分和界定不同物種[1]。《實用中藥種子技術手冊》《中國藥用植物種子原色圖鑒》均較為直觀地提供了各種子的基本特征，為后續深入研究提供了依據[8-9]。需要注意的是，應用傳統性狀特征進行鑒定，需建立種子標本實物庫和信息庫，為種子鑒定提供詳細的實物和數據信息。

1.1.2 微性狀鑒定 微性狀鑒定一般借助放大鏡、掃描儀及低倍顯微儀器等來分析觀察，具有簡單、快速、廉價的優點[10]。韋穎[6]通過研究比較了105 種藥用植物果實和種子的性狀、微性狀及顯微結構，為中藥材果實、種子的真偽鑒別提供依據。高飛燕[11]對種子類中藥微性狀進行研究發現，不同種子表面一般都有不同的微性狀特征，可作為微性狀鑒別依據。王軍等[12]在鑒別南鶴虱、小茴香、肉豆蔻3 種果實種子類藥材時，在采用傳統性狀鑒別方法的同時結合微性狀鑒別方法，更好地將藥材與其偽品進行區分鑒別。胡文璐等[13]采用中藥微性狀鑒定法對21 批車前子正品和7 種車前子偽品進行觀察比較，結果顯示，車前子正品與偽品的微性狀區別明顯。王雪利等[14]對紫蘇子及其混偽品表面的微性狀特征進行觀察和研究，并利用中藥微性狀鑒定法成功對其進行真偽鑒別。

1.2 顯微鑒定

種子的顯微鑒別是指通過顯微鏡觀察中藥材種子的顯微結構，根據不同物種表現出的不同顯微特征進行鑒定。種皮的表面形態、結構、組成，種子的外胚乳、內胚乳或子葉細胞的形狀，細胞壁增厚情況及所含脂肪油、糊粉粒或淀粉粒等均是顯微鑒別的重要特征[1]。顯微鑒別方法被廣泛應用于中藥材種子的鑒定中，如白術和蒼術的種子外觀上非常相似，在生產、流通和銷售中極易混雜，從而影響種子品質和藥材質量。張杰等[15]通過外觀性狀鑒別和顯微鑒別將白術與蒼術瘦果進行了區分。通過對鐵棒錘和伏毛鐵棒錘的種子粉末進行顯微觀察，發現鐵棒錘種子的外種皮細胞與伏毛鐵棒錘存在差異，以此可鑒別這2種植物[16]。通過顯微觀察發現，川黨參與素花黨參種子的橫切面上的種皮細胞及種胚細胞含有的晶體類型不同，表明素花黨參和川黨參可通過其種子的外觀性狀及顯微特征進行鑒別[17]。黃璐琦[1]主編的《中國中藥材種子原色圖典》圖文并茂地展現了種子的形態特征、微觀特征，是從外觀性狀到微觀特征進行全面系統研究的中藥材種子圖典，填補了我國中藥材種子顯微研究的空白。

1.3 理化分析鑒定

中藥材種子理化分析鑒定法主要包括色譜法、光譜法等。一般將種子進行提取處理后，采取薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）及紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、質譜（MS）、核磁共振（NMR）等方法進行分析，得到能夠標識其化學特征的圖譜[1]。其中，近紅外光譜（NIRS）技術具有分析速度快、可同時分析多種成分、不對樣品造成損傷等優點，在中藥鑒定領域受到了越來越廣泛的關注[18-19]。趙景輝等[20]利用NIRS對不同產地、種類的人參和西洋參種子樣品進行聚類分析并建立了鑒別分析模型，結果顯示所建立的鑒別分析模型能有效地判別人參和西洋參的種子類別。彭惜媛[21]運用多級紅外光譜宏觀指紋分析法對芥子、萊菔子、黑豆、牽牛子等12 種種子進行鑒定，根據種子樣本IR 中吸收峰形狀、峰位置和峰強度等指紋特征對其進行逐級鑒定，逐漸發現樣品之間的共性和差異，提供了系統的種子藥材鑒別方法。

1.4 分子鑒定

分子鑒定一般指依據大分子（蛋白質和核酸）特征的鑒定，分為蛋白質標記技術和DNA 分子標記技術[22]。目前，已有多種相關技術引入中藥材種子種苗真實性鑒定中。

1.4.1 蛋白質標記技術 包括蛋白質電泳、同工酶電泳、特異酶類的活性實驗及抗體反應等[23]。最常用的蛋白質電泳鑒定法是利用中藥種子中所含蛋白質分子大小、形狀或所帶電荷差異，通過電泳分離而鑒別種子的方法。該方法廣泛應用于中藥材種子真實性鑒定中[22]，常見有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和毛細管電泳（CE）[23-24]。張瓊光等[25]對2 種類型厚樸種子蛋白質進行分析，結果顯示，2 種類型厚樸種子蛋白質電泳圖譜有明顯差異，可作為鑒別依據之一。楊玉霞等[26]對大黃及其混偽品的種子蛋白電泳研究結果表明，除偽品大黃（河套大黃）未見有蛋白譜帶外，正、混品大黃具有各自的鑒別譜帶，且在譜帶的級別、分布區域及數量上均有明顯的區別。李曉琳等[27]對15 個產地的刺五加種子和2 個產地的短梗五加種子中可溶性蛋白進行電泳分析，得出不同產地的刺五加種子蛋白電泳圖譜具有一定的種內差異性。該電泳方法和標準蛋白圖譜可作為刺五加及短梗五加種子的鑒別依據。陸國弟等[28]通過研究發現，鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳圖譜在蛋白質譜帶位置和強弱上有一定差異，PAGE 技術可用于鐵棒錘種子純度檢測，其蛋白質圖譜可作為鐵棒錘與伏毛鐵棒錘種子的鑒別依據。

1.4.2 DNA 分子標記技術 DNA 分子標記技術是隨著分子生物學的發展而發展起來的一種新型的鑒定方法，通過分析生物體間具有遺傳信息差異的DNA 片段，進而揭示生物體內在基因的排布規律及其表型性狀的表現規律，具有速度快、靈敏度高、特異性強、準確可靠等優點，且不受生物體生長發育階段、供試部位、實驗條件等因素的影響。DNA分子標記技術有限制片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、簡單序列重復（simple sequence repeats，SSR）、單核苷多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）、DNA 條形碼（DNA barcoding）等[29-30]均為國內外研究熱點。

1.4.2.1 RFLP 技術 RFLP 是由Botsein 等提出的應用最早的分子標記，該方法依據序列差異并產生特定的限制性內切酶酶切位點，酶切后根據酶切片段長度的變化或片段數量的增減進行鑒定[31]。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版一部中收錄了川貝母聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）鑒別法。由于川貝母基因組rDNA 存在限制性內切酶Sma I的單一位點（5′-CCCGGG-3′），而非川貝類的基因組在此處的序列為（5′-CTCGGG-3′），因此可以用這種方法區別川貝母和其他貝母[32-33]。王自強等[34]通過對特征片段進行PCR 擴增，可將梅花鹿及馬鹿來源的骨粉樣品與牛、豬、狗等動物骨粉樣品進行區分，在PCR法的基礎上，采用RFLP 技術，通過對限制性內切酶XbaI 進行酶切后的片段長度進行分析，可進一步區分梅花鹿與馬鹿來源的骨粉樣品。胡氏苘麻與苘麻種子形態較為相似，僅通過種子形態進行準確鑒別存在困難。翟會鋒等[35]對胡氏苘麻和苘麻進行PCR-RFLP 分析，首次從分子水平上對這2 個物種進行了鑒定區分。朱曉燕等[36]利用核糖體內部轉錄間隔區2（ITS2）序列上可被限制性內切酶HpyCH4Ⅲ識別的關鍵差異位點，建立2種不同性狀白茅根的PCR-RFLP鑒別方法。

1.4.2.2 SSR 技術 SSR 是近年來發展起來的建立在PCR 基礎上的第二代分子標記。由于不同物種的SSR 序列及重復次數不同，使SSR 標記在不同物種表現出高度的保守性和重復性，從而可以對不同物種進行準確鑒定[37-38]。SSR 標記技術因具有多態性高和共顯性等優點，在中藥材種質鑒定中也有應用。陳子易等[39]利用SSR 標記技術對人參和西洋參進行了種質資源的鑒別，該方法可實現人參和西洋參的種間鑒定。李春花等[40]利用SSR 標記技術構建云南苦蕎種質資源分子身份證，為云南苦蕎的種質資源鑒定和保護提供依據。

1.4.2.3 DNA 條形碼 DNA 條形碼技術利用一段標準的DNA 序列從基因層面對物種進行鑒定，不受環境等外部因素影響，具有通用、快速、準確等特點，逐漸成為中藥材種子鑒定的研究熱點[41]。羌活與寬葉羌活種子形態特征相似，難以明顯區分，張改霞等[42]基于ITS2 條形碼對27 份藥用植物羌活種子樣品進行分子鑒定，結果表明，27 份種子樣品中有24 份樣品為《中國藥典》2010 年版規定的羌活正品基原種子，包括13 份羌活種子、11 份寬葉羌活種子，另外3 份樣品不屬于羌活基原植物種子。方海蘭等[43]收集了19 份重樓種子、7 份重樓種苗，以ITS為條形碼進行基原物種鑒定，結果表明，有20 份樣品為非《中國藥典》2015 年版基原物種，甚至有重樓屬以外的種屬。劉金欣等[44]通過構建黃芩ITS2 條形碼數據庫，建立黃芩種子DNA 條形碼鑒定新方法，保障黃芩種子基原準確。戚文濤等[3]采用傳統形態鑒定方法結合DNA 條形碼分子檢測技術準確鑒定柴胡屬種子。基于ITS2 條形碼和種子形態鑒定相結合的方法可以準確鑒定柴胡屬種子，41 份柴胡屬種子樣品中有30 份柴胡、3 份狹葉柴胡、5 份三島柴胡、2 份藏柴胡及1 份小葉黑柴胡。將DNA 條形碼技術擴展到中藥材種子種苗鑒定領域，對推動中藥材種子種苗標準化具有重要意義。

1.4.2.4 SNP 技術 1996 年，美國學者Eric S.Lander 正式提出了第三代分子標記技術——SNP[45]。SNP 技術本質是DNA 單堿基變異，通過檢測分析染色體上某個位置單個核苷酸的差異，可以實現區分不同個體遺傳物質的差異，從而辨別不同的物種。與其他傳統分子標記相對比，SNP 分子標記技術分布較廣泛、遺傳較穩定、易于基因型分型鑒定，特別是對于種間的快速鑒定。近年來，SNP 分子標記技術在中藥材種子種苗真實性鑒定中被廣泛研究和應用[29]。Chen 等[46]采用ITS2 序列對人參屬藥用植物的SNP 位點進行研究，發現5 個穩定的可作為獨特標記用來區分人參屬不同物種以及人參、西洋參混合粉末的種間變異位點，首次借助SNP 位點成功鑒定人參、西洋參混合粉末。王麗麗等[47]基于SNP 位點對藏菖蒲及其近緣種進行鑒定，通過對藏菖蒲同屬近緣種的96 條ITS2 序列進行分析，發現第23 位和212位存在穩定的SNP位點，可準確鑒定藏菖蒲。

2 討論與展望

中藥材種子種苗是保證中藥材質量的源頭，優質的種子種苗是實現中藥材規范化生產的基礎和首要條件。當前，中藥材種子種苗交易以個體農戶交易為主，沒有固定的經營主體，門店交易大部分無經營許可證，種子無包裝。區分種子真偽優劣主要是憑經驗，種源混雜，近緣種、混偽品充當正品，質量無法保障。

性狀鑒定、顯微鑒定、理化分析鑒定和分子鑒定作為常用的中藥材種子種苗真實性鑒定方法，各有特點，在針對具體品種制定鑒定方法時應根據實際情況進行選擇。性狀鑒定是目前中藥材種子種苗生產、交易過程中使用最多的鑒定方法，方法簡單、易操作、節約時間，但對鑒定者經驗水平要求較高。微性狀鑒定是目前中藥材種子鑒定的發展趨勢。該方法既可以彌補經驗方面誤差與不足又能夠快速鑒別種子類中藥材，非常適用于基層中藥快檢工作。顯微鑒定主要是通過種子橫切面的不同組織構造的比較作為鑒別特征來辨別，不受外觀形態影響。中藥材種子理化分析鑒別方法對實驗設備的配置、操作技術及實驗條件均有較高要求，且只針對含特定成分的中藥材種子，具有一定局限性。DNA 分子標記技術是近年發展起來的一種新型的鑒定方法，具有簡便、快速、準確的特點。但無論在廣度還是深度上，當前研究所涉及的分子標記類型仍有不足，其更為廣闊的應用前景還有賴于DNA 分子標記技術的進一步發展。

與中藥材種子種苗鑒定現狀相比，我國農作物種子檢驗質量標準體系已基本形成并建立了健全的種子質量監督抽查制度，擁有種子質量檢驗隊伍和網絡[48]，采用大田形態鑒定法、生化標記鑒定法和DNA 分子標記鑒定法可以實現農作物種子的真偽鑒別[23]。中藥材種子種苗質量控制體系建設工作還有待進一步完善[49]，可參考農作物種子鑒定相關的技術方法，制定實施系統全面的質量標準和檢測技術，促進中藥材產業健康發展。

中藥材種子種苗真實性鑒定技術要取得進一步發展，筆者認為可從以下幾個方面開展深入研究：首先，加強中藥材種子鑒定與分類系統基礎研究。目前，藥學界對中藥材種子種苗的鑒定研究缺乏足夠的重視，尚未建立完善的、綜合各種種子特征的鑒定與分類體系[50]，導致對種子的鑒定困難重重。因此，開展種子鑒定與分類系統的課題研究是中藥材種子種苗真實性鑒定的基礎。其次，借助基因組學和生物信息學等先進技術，擴展DNA 分子標記技術在中藥材種子種苗近緣種及不同產地種子鑒別中的研究和應用。最后，提高種子質量意識，規范中藥材種子種苗交易市場。中藥材種子交易以個體農戶交易為主，種子質量意識淡薄，真實性鑒定多通過主觀進行判斷，造成種子質量事故時有發生。因此，應規范中藥材種子種苗生產與經營、建立出廠放行制度、采用現代分析技術在中藥材種子種苗質量標準中對種子真實性鑒定提出明確要求并在生產實踐中推廣應用。