13C標(biāo)記的PLFA法在微生物學(xué)中的應(yīng)用及其在中藥生態(tài)種植研究領(lǐng)域的展望△

劉長(zhǎng)征，姜曉琳，蔡啟忠，楊全，周良云

廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局 嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室/國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗(yàn)站/廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

碳循環(huán)是生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物地球化學(xué)元素循環(huán)之一[1]，微生物參與了其中多個(gè)重要的循環(huán)過程。了解微生物在碳循環(huán)過程中的具體作用，有助于揭示微生物對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制。磷脂脂肪酸(PLFA)作為微生物的標(biāo)志物已被世界各地的學(xué)者廣泛應(yīng)用到微生物的定性、定量研究中。但是單純的PLFA法并不能揭示特定微生物的代謝過程，無法研究特定微生物的功能。結(jié)合13C的PLFA法可以揭示微生物參與的碳循環(huán)過程，因此，可用于解決這一問題。隨著質(zhì)譜等相關(guān)技術(shù)的日趨成熟，13C標(biāo)記的PLFA法已成為研究微生物群落功能的一種常用方法。本文通過梳理大量文獻(xiàn)，綜述13C標(biāo)記的PLFA法在微生物介導(dǎo)的植物-土壤碳循環(huán)和某些特定微生物上的應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行展望，以期為中藥生態(tài)種植的研究提供參考。

1 PLFA法簡(jiǎn)介

PLFA是構(gòu)成活體細(xì)胞膜的重要組分，在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下相對(duì)穩(wěn)定，不同類群的微生物能通過不同生化途徑形成不同的PLFA，部分PLFA總是出現(xiàn)在同一類群的微生物中，而在其他類群的微生物中很少出現(xiàn)[2]。由于磷脂不能作為細(xì)胞的貯存物質(zhì)，一旦生物細(xì)胞死亡，其中的磷脂化合物就會(huì)迅速分解，在細(xì)胞外環(huán)境中的PLFA量少且不穩(wěn)定，因此，PLFA可以作為活體微生物的標(biāo)記物[3]，用于研究微生物的種類和數(shù)量。

20世紀(jì)70年代，White等[4]開始用PLFA法對(duì)河口沉積物中的微生物進(jìn)行分析。此后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐漸利用此法對(duì)河海沉積物[5]、土壤[6]、發(fā)酵物[7]中的微生物進(jìn)行定性或定量分析。20世紀(jì)80年代，Boschker等[8]提出通過添加13C標(biāo)記的生物標(biāo)志物與PLFA法相結(jié)合的方法，將微生物種群與特定的生物化學(xué)過程聯(lián)系起來。原則上，所有涉及生物吸收和消耗碳的過程都可以通過添加標(biāo)記物的方法進(jìn)行研究。將穩(wěn)定同位素標(biāo)記與PLFA法2種方法相結(jié)合，對(duì)研究土壤中特定有機(jī)質(zhì)循環(huán)有著極為重要的意義[9]。

2 13C標(biāo)記的PLFA法原理

將同位素標(biāo)記后的物質(zhì)添加到特定環(huán)境中，可以被微生物直接或間接吸收，然后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為可被檢測(cè)的PLFA。對(duì)含有添加同位素的PLFA進(jìn)行檢測(cè)分析，可以得到參與代謝添加物質(zhì)的微生物信息[8]。目前，最為常用的同位素標(biāo)記方法是13C標(biāo)記法，13C作為穩(wěn)定同位素其靈敏度高且無放射性危害[10]。碳作為有機(jī)生命的主要構(gòu)成元素，直接參與到所有生物的代謝活動(dòng)中，因此，13C標(biāo)記法還具有普遍適應(yīng)性，這使得13C標(biāo)記的PLFA法安全、有效且適用范圍較廣。13C標(biāo)記的PLFA法可以將特定微生物與其功能聯(lián)系起來，提供有關(guān)微生物間相互作用及其代謝功能的直接信息，并且操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)成本低，因此，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于確認(rèn)土壤微生物的生態(tài)功能、追蹤碳元素在微生物群體和個(gè)體間的流動(dòng)等方面的研究中[11-12]。

3 13C標(biāo)記的PLFA法的應(yīng)用

3.1 參與植物-土壤碳循環(huán)的微生物研究

3.1.1植物殘?bào)w的微生物分解研究 植物殘?bào)w是土壤有機(jī)質(zhì)形成的主要母質(zhì)，植物殘?bào)w的分解是全球碳循環(huán)中的關(guān)鍵一步，并且可以為土壤微生物的生命活動(dòng)提供物質(zhì)和能量[13-14]。土壤微生物在植物殘?bào)w的分解中具有不可替代的作用，因此，可以通過研究土壤微生物來了解植物殘?bào)w的分解過程[15]。Williams等[16]在土壤中分別添加被13C標(biāo)記過的絳車軸草TrifoliumincarnatumL.和1年生多花黑麥草LoliummultiflorumLam.的根及秸稈，并測(cè)量了土壤PLFA中的13C含量。發(fā)現(xiàn)4種處理中部分PLFA(16：1ω5和10Me17：0)中13C始終維持在很低的水平，而部分PLFA(16：0、18：1ω9和18：2ω6，9)總是含有較高比例的13C，研究表明，在土壤中存在的部分微生物負(fù)責(zé)同化殘留物。Pan等[17]將13C標(biāo)記的水稻秸稈及其衍生生物炭施用于水稻田中，研究其分解過程對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響。根據(jù)PLFA中13C數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，23種不同的PLFA參與分解水稻秸稈，而只有17種PLFA參與分解水稻秸稈衍生生物炭。此結(jié)論與Williams等的結(jié)論有一定的相似之處，并不是土壤中的所有微生物都參與了植物殘?bào)w的分解。

殘?bào)w的種類及土壤的種類、深度等性質(zhì)均影響微生物對(duì)植物殘?bào)w的分解。Bai等[18]在土壤中添加了3種13C標(biāo)記的小麥殘?bào)w(麥粒、葉和根)，利用土壤中的PLFA來描繪微生物群落的動(dòng)態(tài)變化。研究結(jié)果顯示，不同植物殘?bào)w產(chǎn)生的CO2和PLFA的量有顯著區(qū)別，其中麥粒最多，葉次之，根最少。Hicks Pries等[19]在不同深度(15、55、95 cm)的土壤中添加13C標(biāo)記的野燕麥AvenafatuaL.根，發(fā)現(xiàn)30個(gè)月時(shí)，殘?bào)w在15 cm的分解速度比95 cm的快。Arcand等[20]探討長(zhǎng)期有機(jī)管理和常規(guī)管理是否會(huì)導(dǎo)致微生物在小麥殘?jiān)纸馍袭a(chǎn)生差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)土壤相比，有機(jī)管理土壤中真菌尤其是放線菌在小麥殘?jiān)纸馍习l(fā)揮更重要的作用。仇存璞等[21]也證實(shí)，土壤原有有機(jī)質(zhì)可以對(duì)參與秸稈分解微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

3.1.2參與土壤激發(fā)效應(yīng)的微生物研究 激發(fā)效應(yīng)是由于相對(duì)溫和的土壤處理引起的土壤有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)率的強(qiáng)烈短期變化，這些處理措施包括施肥、根系滲出有機(jī)物質(zhì)、對(duì)土壤機(jī)械處理、土壤的干燥和再濕潤(rùn)等[22]。土壤微生物對(duì)外源有機(jī)質(zhì)輸入的響應(yīng)是形成激發(fā)效應(yīng)的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力[23-25]，可以通過研究土壤微生物來認(rèn)識(shí)土壤激發(fā)效應(yīng)。Nottingham等[26]在土壤中添加13C標(biāo)記的蔗糖和玉米ZeamaysL.秸稈，由PLFA(16：1ω5和16：1ω7)鑒定的某些革蘭陰性細(xì)菌，在蔗糖和玉米處理中都表現(xiàn)出對(duì)土壤碳的吸收增加，并且可能與啟動(dòng)效應(yīng)直接相關(guān)。Wang等[27]將13C標(biāo)記的新鮮玉米葉和莖添加到土壤中，研究新鮮有機(jī)質(zhì)質(zhì)量的變化對(duì)土壤激發(fā)效應(yīng)的影響。發(fā)現(xiàn)與添加莖的土壤相比，添加葉片的土壤中微生物生長(zhǎng)更快，但是16 d后則相反。并且認(rèn)為，微生物對(duì)碳和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求是土壤激發(fā)效應(yīng)的主要決定因素之一。Qiao等[28]借助13C標(biāo)記的PLFA法發(fā)現(xiàn)，真菌在幼林土壤的啟動(dòng)效應(yīng)中具有重要作用。

除了向土壤中添加植物殘?bào)w可以引起土壤激發(fā)效應(yīng)外，植物本身也會(huì)引起激發(fā)效應(yīng)。植物根系參與的土壤有機(jī)質(zhì)分解的變化，稱為根際激發(fā)效應(yīng)(RPE)[29-30]。Bird等[31]在1項(xiàng)為期2年的溫室研究中，在種植裂稃燕麥AvenabarbataPott ex Link和非種植條件下，用13C標(biāo)記的地下碳(根系和有機(jī)質(zhì))。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未種植的土壤相比，活根增加了地下13C的周轉(zhuǎn)率和損失，并且其中的革蘭陽性菌對(duì)地下13C的長(zhǎng)期利用得到了增強(qiáng)。因此認(rèn)為，革蘭陽性菌的活性可能是激發(fā)作用主要調(diào)控因子。Kou等[32]采用天然13C示蹤劑對(duì)大豆和棉籽木3個(gè)生長(zhǎng)期的RPE進(jìn)行定量分析，使用PLFA測(cè)定土壤微生物和線蟲的群落組成，并探討其與RPE的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)期RPE差異較大，大豆產(chǎn)生的累積RPE>棉籽木，大豆處理組發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌PLFA值較高，也表現(xiàn)出植物種類效應(yīng)。分析結(jié)果表明，微生物群落的變化與RPE、土壤和植物特性密切相關(guān)，線蟲群落通過改變微生物群落結(jié)構(gòu)間接影響RPE。因此，根際土壤微食物網(wǎng)的相互作用可以調(diào)節(jié)微生物的周轉(zhuǎn)或微生物群落的組成，從而調(diào)節(jié)RPE。

3.1.3促進(jìn)根際碳循環(huán)的叢枝菌根(AM)真菌研究 AM是陸生高等植物的根部與真菌菌絲所形成的一種結(jié)合體，是一種共生現(xiàn)象[33]。AM真菌在根部定植后，寄主植物發(fā)生了深刻的生理變化，不僅可以促進(jìn)寄主植物從土壤中吸收礦質(zhì)元素和水分，還可以把植物中的碳傳輸?shù)酵寥乐校⒄{(diào)節(jié)土壤有機(jī)質(zhì)的分解[34-36]。Paterson等[37]用13CO2脈沖標(biāo)記黑麥草，采用不同孔徑的網(wǎng)格控制根系和叢枝菌根菌絲進(jìn)入土壤，并定量PLFA和土壤釋放CO2中的13C。證明了叢枝菌根除影響凋落物分解速率外，對(duì)原生土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化也有重要影響。Herman等[38]在種植長(zhǎng)葉車前PlantagolanceolataL.的土壤中添加13C標(biāo)記的長(zhǎng)葉車前的根凋落物，研究AM真菌對(duì)凋落物分解的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，根凋落物在分解時(shí)，含有AM真菌的組中，革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和AM真菌(16：1ω5c)對(duì)13C的富集程度低于不含AM真菌的處理組。這種富集現(xiàn)象可能是由AM真菌將植物中的13C提供到土壤微生物群落中產(chǎn)生，因此，這種碳輸入具有可以改變凋落物分解的中介作用。

但是AM的作用會(huì)受到外來物種、水分條件等影響。Dierks等[39]在研究旱雀麥BromustectorumL.入侵對(duì)蒿屬植物草原AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，用13CO2脈沖標(biāo)記蒿屬植物，并通過含13C的PLFA來評(píng)估土壤微生物。發(fā)現(xiàn)旱雀麥的入侵能改變AM真菌的群落結(jié)構(gòu)，降低了AM真菌的豐富度。Bao等[40]利用13CO2標(biāo)記并計(jì)算水稻在不同淹水條件下向AM真菌轉(zhuǎn)移的碳量。結(jié)果表明，在所有淹水條件下，均有植物同化碳轉(zhuǎn)移給AM真菌，AM真菌PLFA中13C顯著富集，但是隨著淹水強(qiáng)度的增加，AM真菌中的碳轉(zhuǎn)移量呈下降趨勢(shì)。此外還發(fā)現(xiàn)，土壤中原生動(dòng)物[41]、不同樹種[42]、土壤氮含量[43]均對(duì)AM的作用產(chǎn)生不同程度的影響。

3.1.4光合作用產(chǎn)物的微生物利用研究 植物通過光合作用固定大氣CO2，生成的部分有機(jī)物，并可以通過根部釋放到土壤中。土壤中的微生物則會(huì)對(duì)這部分有機(jī)物進(jìn)行分解利用，除了滿足自身發(fā)育需要，還將部分有機(jī)碳以CO2的形式釋放到大氣中。因此，研究光合作用產(chǎn)物的微生物利用過程對(duì)于認(rèn)識(shí)全球碳循環(huán)具有重要意義。Butler等[44]最早將13C標(biāo)記PLFA法應(yīng)用到植物光合作用產(chǎn)物的根際微生物利用研究中，并且證明了該方法的可行性。此后大量學(xué)者使用類似的方法研究光合作用產(chǎn)物在土壤中的循環(huán)，其中多數(shù)學(xué)者采用13CO2脈沖或連續(xù)標(biāo)記，相關(guān)研究[45-46]則借助C3植物和C4植物在光合作用中對(duì)13C同化量的差異來達(dá)到標(biāo)記效果。

Chaudhary等[47]采用13CO2脈沖標(biāo)記柳枝稷PanicumvirgatumL.，并分析根際土壤中PLFA與根際沉積碳的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，真菌和革蘭陰性菌PLFA中的13C富集速度快于革蘭陽性和放線菌，但是放線菌PLFA中13C的比例隨采樣時(shí)間的增加而顯著增加。Yuan等[48]在水稻的不同生長(zhǎng)期進(jìn)行13CO2脈沖標(biāo)記，并分析了水稻根際土壤中的PLFA，發(fā)現(xiàn)根際土壤中真菌PLFA中13C的比例最高，放線菌PLFA的13C則是最小的。此外，還發(fā)現(xiàn)干旱[49]、植物種類[50]、物種多樣性[51]、施肥[52-54]均會(huì)對(duì)微生物對(duì)光合作用產(chǎn)物的分解利用產(chǎn)生不同程度的影響。可能是影響因子的變化首先影響到植物釋放到土壤中有機(jī)物的性質(zhì)和數(shù)量，繼而影響微生物對(duì)有機(jī)物的利用過程，或者是影響因子的變化直接影響到了土壤中微生物的組成。

3.2 特定微生物研究

3.2.1甲烷氧化菌 甲烷(CH4)是一種僅次于CO2的溫室氣體，且其溫室效應(yīng)能力遠(yuǎn)高于CO2。土壤中甲烷氧化菌對(duì)CH4的氧化消耗是大氣CH4唯一的生物匯，甲烷氧化菌對(duì)于維持大氣中CH4的濃度、降低溫室效應(yīng)有較為重要的意義[55-56]。因此，學(xué)者利用13C標(biāo)記的PLFA法來研究了甲烷氧化菌對(duì)CH4的氧化作用。Zigah等[57]利用13C標(biāo)記的PLFA法分析了基伍湖水柱中CH4氧化途徑和相關(guān)的甲烷氧化菌群落。實(shí)驗(yàn)證明，湖水中CH4的主要氧化途徑是Ⅱ型甲烷氧化菌介導(dǎo)的好氧氧化。一種新型的厭氧甲烷氧化古菌(ANME)而不是已知的ANME-1和ANME-2參與了CH4的厭氧氧化。Henneberger等[58]研究了垃圾填埋場(chǎng)覆蓋土壤中活躍的甲烷氧化菌在空間和季節(jié)上的差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在活躍的甲烷氧化菌群體中表現(xiàn)出明顯的空間和季節(jié)差異，并且發(fā)現(xiàn)Ⅰ型甲烷氧化菌特別是甲基單胞菌和甲狀桿菌是CH4的主要氧化菌群。Crossman等[59]從垃圾填埋場(chǎng)取得的富含甲烷氧化菌的黏土和沙土，然后用13C標(biāo)記的CH4進(jìn)行孵育。PLFA分析后得知，黏土中甲烷氧化細(xì)菌群落隨深度變化而變化，而沙土在整個(gè)深度都表現(xiàn)出Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌混合。可能是沙土透氣性較高，使得CH4可以滲透土壤，而黏土則限制了CH4的滲透。植物可以通過改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)來改變土壤功能。Menyailo等[60]研究了不同樹種對(duì)于土壤甲烷氧化菌的影響，發(fā)現(xiàn)樹種改變了大氣CH4氧化活性，但沒有改變甲烷氧化菌的組成。Tate等[61]則指出植被、土壤質(zhì)地和充水孔隙空間都會(huì)影響甲烷氧化菌對(duì)CH4的氧化，且影響這些特定生態(tài)系統(tǒng)中CH4吸收的似乎是多種因素的組合，而不是單個(gè)因素。

3.2.2浮游植物 浮游植物廣泛分布于江河湖海中，是全球生物碳、氮、氧、硅、磷和鐵的循環(huán)中心，是水體生態(tài)系統(tǒng)中最重要的初級(jí)生產(chǎn)者[62]。浮游植物作為水體其他生物的直接或間接的食物來源，是維持水體生物多樣性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。浮游植物是水體溶氧的主要提供者，在維持大氣中CO2的濃度上具有無法替代的位置[63]。同時(shí)，浮游植物對(duì)環(huán)境變化較為敏感，因此，其種類組成與優(yōu)勢(shì)種類群等數(shù)據(jù)可以用來監(jiān)測(cè)水體環(huán)境[64-65]。13C標(biāo)記的PLFA法可以用來估算特定浮游植物的產(chǎn)量，也可以用以研究“浮游植物-細(xì)菌”食物鏈。Dijkman等[66]發(fā)現(xiàn)，在藻類培養(yǎng)中，以13C標(biāo)記的PLFA為基礎(chǔ)計(jì)算生長(zhǎng)速度，以生物量增加為基礎(chǔ)計(jì)算生長(zhǎng)速度時(shí)，PLFA濃度和細(xì)胞數(shù)上呈現(xiàn)一致性。證明可以通過藻類的PLFA來估算特異性初級(jí)產(chǎn)物產(chǎn)量。同樣是在斯凱爾特河中，Boschker等[67]對(duì)河流春季繁殖期浮游生物群落結(jié)構(gòu)和同位素組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在河流下游的近海一側(cè)，細(xì)菌和藻類PLFA中的同位素比值相似，表明藻類生產(chǎn)與有機(jī)物的細(xì)菌消耗之間存在耦合關(guān)系。然而在河流上游，與藻類PLFA相比，細(xì)菌PLFA的中13C值較高，表明該河流存在一個(gè)非耦合的藻類-細(xì)菌系統(tǒng)，并有陸源有機(jī)質(zhì)或污水等支持細(xì)菌生長(zhǎng)，并非藻類可以完全支持細(xì)菌的生長(zhǎng)。De Kluijver等[68]研究CO2濃度上升對(duì)浮游植物向細(xì)菌轉(zhuǎn)移碳的潛在影響。在不同CO2濃度下培養(yǎng)浮游植物，用含13C碳酸氫鹽進(jìn)行標(biāo)記。利用PLFA的同位素比值來推斷浮游植物和細(xì)菌的生物量和產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)CO2濃度升高對(duì)綠藻、硅藻和細(xì)菌的生物量有顯著的正向影響，但是對(duì)浮游植物向細(xì)菌的碳轉(zhuǎn)移效率沒有顯著影響。

4 在中藥生態(tài)種植研究領(lǐng)域的展望

藥用植物與其根際微生物聯(lián)系密切，根際微生物對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、次生代謝產(chǎn)物的積累等均具有重要影響，開展藥用植物與其根際微生物的互作研究對(duì)于中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有指導(dǎo)意義[69]。PLFA法也已經(jīng)被應(yīng)用到藥用植物的根際微生物研究中。李建鵑等[70]利用PLFA技術(shù)研究連作木麻黃根際土壤微生物，發(fā)現(xiàn)隨栽培代數(shù)增加，細(xì)菌含量減少，真菌含量增加。鄒立思等[71]也利用PLFA技術(shù)研究4個(gè)產(chǎn)地太子參的根際土壤微生物，發(fā)現(xiàn)4個(gè)產(chǎn)地太子參的PLFA在種類和組成比例上存在很大的差異。目前，中藥對(duì)于PLFA法在中藥中的應(yīng)用范圍較窄，一般只是對(duì)中藥材根際土壤的PLFA進(jìn)行種類和數(shù)量上的差異性比較，并沒有利用13C標(biāo)記的PLFA法進(jìn)行研究的案例。13C標(biāo)記的PLFA法作為一種成熟的研究微生物動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)，在確認(rèn)藥用植物根際微生物的功能、篩選有益微生物、揭示藥用植物-土壤-微生物關(guān)系上具有較大的優(yōu)勢(shì)，因此，在中藥生態(tài)種植研究領(lǐng)域具有廣闊的前景。

4.1 篩選增加藥用植物抗性的AM真菌

AM作為分布廣泛的植物與真菌共生體，其對(duì)植物的保護(hù)功能一直是研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)代研究表明，AM真菌可以促進(jìn)宿主植物對(duì)于氮、磷等元素的吸收[72-73]，提高宿主植物的耐旱、耐鹽、耐重金屬的能力[74-76]。在中藥材農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，AM真菌可以通過增加藥用植物的抗性來提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量[77]。

AM為植物和土壤之間的物質(zhì)橋梁，連通著寄生植物和土壤微生物。使用13C標(biāo)記的PLFA法可以追蹤碳從宿主植物到AM真菌，再到土壤微生物的過程，并且計(jì)算出碳的轉(zhuǎn)移量，能從微生物層面上揭示植物、AM和土壤微生物之間的關(guān)系。因此，13C標(biāo)記的PLFA法在中藥種植方面為篩選提高藥用植物抗逆性的AM真菌，提高AM侵染率提供理論依據(jù)。以期通過添加有益AM真菌增加藥用植物抗性，達(dá)到減肥減藥、提高植物成活率、實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益的雙贏的目的。

4.2 篩選緩解藥用植物連作障礙的微生物

根和根莖類藥材約占藥用植物的70%，且絕大數(shù)根和根莖類藥材存在連作障礙[78]。藥用植物連作障礙可以降低種子發(fā)芽率，增加土傳病害發(fā)生率，降低中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)，阻礙中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。周芳等[79]認(rèn)為，植物-土壤-微生物共同作用引起藥用植物連作障礙，但三者之間的內(nèi)在影響機(jī)制還不夠明確。根據(jù)藥用植物特點(diǎn)開發(fā)新的微生物制劑來緩解藥用植物連作障礙，對(duì)于提高藥用植物產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義[80-82]。

使用13CO2對(duì)藥用植物進(jìn)行脈沖標(biāo)記或者連續(xù)標(biāo)記，并通過含13C的PLFA定位可以利用根系分泌物的土壤微生物或直接向土壤中添加13C標(biāo)記的已知自毒物質(zhì)，分析根際微生物的變化，找到參與代謝自毒物質(zhì)的土壤微生物并通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)該部分微生物緩解植物連作障礙的能力。因此，13C標(biāo)記的PLFA法可以為篩選有益生防菌來緩解藥用植物連作障礙提供數(shù)據(jù)支持。

4.3 非藥用部位堆肥還田評(píng)價(jià)

藥用植物收獲后的非藥用部位一直是以丟棄為主，浪費(fèi)資源，若處理不當(dāng)還可能造成環(huán)境污染，影響人類健康。而將非藥用部位堆肥還田處理，很好地解決了藥用植物非藥用部位隨意丟棄的問題，也減少了化肥的使用，實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用，符合中藥生態(tài)種植理念。

使用13C標(biāo)記生長(zhǎng)期的藥用植物，并在收獲后將非藥用部位進(jìn)行堆肥實(shí)驗(yàn)。可以通過13C 標(biāo)記的PLFA找到參與腐熟的微生物群落，獲得不同腐熟階段優(yōu)勢(shì)菌種信息。堆肥施用后，還可通過13C標(biāo)記的PLFA法檢測(cè)土壤微生物的變化情況。因此，13C標(biāo)記的PLFA法可以用來研究堆肥腐熟進(jìn)程，調(diào)控堆肥條件，并且根據(jù)對(duì)土壤微生物群落的影響情況來評(píng)價(jià)肥料的質(zhì)量。

5 結(jié)語

綜上所述，13C標(biāo)記的PLFA法在揭示微生物功能方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。藥用植物的種植與微生物息息相關(guān)，特別是藥用植物生態(tài)種植領(lǐng)域提倡以菌治病，菌根真菌等生態(tài)農(nóng)業(yè)常用技術(shù)的使用，更加注重微生物在藥用植物種植中的應(yīng)用。因此，使用13C標(biāo)記的PLFA法揭示微生物與植物的關(guān)系，促進(jìn)相關(guān)微生物技術(shù)在藥用植物生態(tài)種植領(lǐng)域的應(yīng)用，有助于推動(dòng)中藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。