溫經通絡湯對小鼠膝骨關節炎軟骨形態改變和VEGF、MMP-13、HIF-1α表達情況的影響

許煒民，錢佳佳，韓龍，許奇，黃桂成,2*

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院，江蘇 南京 210023)

膝骨關節炎是我國乃至世界范圍內中老年的常見病之一，其發生發展的過程與年齡、體質量、創傷、運動習慣、地理環境等諸多因素密切相關。膝骨關節炎的發生，給廣大患者日常生活造成了極大的痛苦與不便。據統計，我國60周歲以上的人群中，其中65歲以上人群發病率超過50%，75歲以上人群則高于80%[1]。。江蘇省中醫院黃桂成教授在治療此類疾病時，認為其發病機理無非是風、寒、濕三種致病因素侵襲肌理，從而造成局部的疼痛、腫脹、運動障礙。在治療過程中運用祛風散寒、溫通經脈、活血止痛等方法，往往能達到藥到病除的效果。本研究自2019年5月—2019年11月研究溫經通絡湯對膝骨關節炎小鼠的治療作用及其作用機制是否與血管侵襲即VEGF信號通路有關。旨在觀察溫經通絡湯對血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)和缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的影響，以進一步明確其對KOA的治療作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康3月齡C57BL/6雄性小鼠30只，體質量(20±2)g，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，許可證號SCXK(蘇)2012-0008，合格證號：201831343。在無特定病原體(SPF級)條件下常規喂養，12 h/12 h光暗交替，恒溫恒濕，標準化顆粒飼料、飲用水、墊料及其他相關物品均經滅菌處理。本實驗方案由南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核(201904A009)。

1.2 分組

將小鼠在20 ℃～26 ℃(SPF級)實驗室適應性喂養7 d，依據隨機分配原則分為5組，每組6只。分別為假手術組(A組)、模型組(B組)、溫經通絡湯高劑量組(C組)、溫經通絡湯低劑量組(D組)和陽性藥(美洛昔康)組(E組)。

1.3 主要試劑及儀器設備

蘇木素染液、伊紅染液(中國，南京建成公司，D005)；VEGF、MMP-13、HIF-1α ELISA檢測試劑盒(鎮江愛必夢生物科技有限公司)；石蠟切片機(Leica,RM2245)；組織包埋機(Leica，EG1150H/C)；免疫組化筆(中國，江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGSP10)；倒置生物顯微鏡(CKX31，Olympus，日本)。

1.4 藥物制備及干預處理

依據《中藥藥理研究方法學》劑量估換計算公式：dB=dA×KB/KA，將成人每日服藥量折算為小鼠每日服藥量(溫經通絡湯組成：制附子、桂枝、熟地黃、土茯苓、澤瀉、陳皮、膽南星、延胡索、全蝎、蜈蚣、懷牛膝和甘草。均由江蘇省中醫院藥劑科提供)。將溫經通絡湯煎煮濃縮至2 g/mL，每只小鼠每日灌胃0.2 mL。將美洛昔康膠囊內粉末溶于水，并定容為10 mL/(kg·d)。造模成功后A組與B組分別予以10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，C組(藥物濃度為2 g/mL)與D組(藥物濃度為1 g/mL)分別予以10 mL/(kg·d)溫經通絡湯灌胃，E組予以10 mL/(kg·d)美洛昔康水溶液灌胃，持續2周。

2 檢測指標與方法

2.1 模型建立

對于A組的C57BL/6小鼠，打開關節腔后直接縫合。其余各組予以ACLT法建立膝骨關節炎模型：實驗小鼠予以戊巴比妥鈉麻醉后取仰臥位，于膝關節內側面做約7 mm縱向切口，眼科剪逐層玻璃皮下組織，膝關節伸直位時將臏前韌帶推向外側脫位，脫位后屈曲膝關節，打開關節囊，于關節腔內準確定位前交叉韌帶，體式顯微鏡下用顯微剪離斷前交叉韌帶，止血并關閉手術創口。術后連續3 d青霉素0.4 MU/d肌注，預防感染。置于標準動物飼養籠中允許其自由活動及進食，無特殊干預下繼續飼養4周。

2.2 組織學觀察

造模成功及給藥干預結束后，解剖各組實驗小鼠的右側膝關節。保留部分股骨及脛骨平臺，取下完整的膝關節后4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣，二甲苯透明后制作厚度為5 μm的石蠟切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，生物顯微鏡下觀察后進行Mankin's評分。

2.3 免疫組織化學

保留部分股骨及脛骨平臺，取下完整的膝關節后4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣，二甲苯透明后制作厚度為5 μm的石蠟切片。將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復緩沖液的染色盒內，放至微波爐中，中高火檔至加熱10 min，將染色盒取出浸入流水中。自然冷卻后用PBS浸洗3次。每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫(15 ℃～25 ℃)封閉10 min。PBS浸洗3 min×3次，滴加1%BSA 50～100 μL,室溫孵育20 min。甩去，不洗。滴加一抗50～100 μL，4 ℃過夜。PBS浸洗3 min×3次。滴加增強劑50 μL，室溫濕盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次。

一抗二抗反應：滴加通用型鼠/兔聚合物50 μL，室溫37 ℃濕盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次。每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液。鏡下觀察染色深淺，染好立即終止,用自來水輕柔沖洗15 min用蒸餾水終止顯色反應。將切片放入蘇木素染液，染色10 min，用蒸餾水沖洗干凈。如染色過深，可用0.1% HCl分化，自來水沖洗后返藍。分別用70%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；無水乙醇乙醇中浸泡5 min。用二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min。在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。光學顯微鏡下觀察組織細胞中蛋白的表達情況，取3個高表達區域拍照保存(所有圖片均400倍拍攝)。

2.4 酶聯免疫吸附檢測

造模成功及給藥干預結束后，眼球取血1.5 mL，靜置后離心(4 ℃，2 000 r/min，30 min)，吸取上層血清，并分裝于離心管中，-80 ℃保存。按照酶聯免疫吸附檢測試劑盒使用說明書檢測各組血清中VEGF，MMP13的含量。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 軟骨組織學觀察及Mankin's評分

假手術組(A組)的小鼠膝關節軟骨表面光滑，細胞排列規則，潮線完整，結構清晰，染色正常；模型組(B組)的小鼠膝關節軟骨表面不完整，可見部分軟骨脫落，未見清晰的軟骨結構及潮線；高劑量組(C組)小鼠膝關節軟骨面光滑完整，局部深染，無軟骨斷裂及剝脫，潮線連續度尚可；低劑量組(D組)小鼠膝關節軟骨表面連續，軟骨結構較清晰，染色尚可，潮線模糊，有輕度失染；陽性藥(美洛昔康)組(E組)小鼠膝關節軟骨表面光滑度尚可，局部修復，未見明顯軟骨斷裂及剝脫，重度深染，潮線模糊。見圖1。

圖1 溫經通絡湯干預2周后各組小鼠膝關節軟骨HE染色(×400)

膝關節軟骨的Mankin's評分顯示：與假手術組相比，其余各組的評分均明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，高劑量組、低劑量組、陽性藥組的評分則明顯下降(P<0.05)。高劑量組的評分低于低劑量組和陽性藥組(P<0.05)，低劑量組與陽性藥組的評分無統計學差異。結果見表1。

表1 各組膝關節軟骨的Mankin's評分比較分)

3.2 ELISA檢測血清中VEGF、MMP-13表達

ELISA檢測結果顯示，造模成功并干預2周后，與假手術組相比，其余各組的小鼠血清中VEGF及MMP-13表達均有明顯升高(P<0.05)，其中模型組小鼠血清中VEGF及MMP-13的表達最高，高劑量組、低劑量組、陽性藥組與模型組相比均有下降(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組血清中VEGF、MMP-13表達情況比較

3.3 免疫組織化學檢測各組小鼠膝關節軟骨中的VEGF, MMP-13及HIF-1α的表達

造模成功并干預2周后，高劑量組、低劑量組和陽性藥組中小鼠膝關節軟骨中的VEGF表達相較于模型組組均有明顯下降，其中陽性藥組的表達最低，接近于假手術組的水平。低劑量組、高劑量組和陽性藥組的VEGF表達呈遞減趨勢。該部分實驗證實了中藥復方溫經通絡湯在治療膝關節骨性關節炎的過程中，對膝關節中存在的血管新生與侵襲的確存在抑制作用。其可通過抑制膝關節中VEGF的表達，從而減慢膝關節內骨-軟骨交界處的血管新生和向軟骨內侵襲的過程。見圖2、圖3和表3。

圖2 免疫組化檢測各組小鼠膝關節軟骨中VEGF的表達(×400)

表3 各組小鼠膝關節軟骨中的VEGF,MMP-13及HIF-1α表達比較

圖3 小鼠膝關節軟骨中的VEGF表達比較

造模成功并干預2周后，高劑量組、低劑量組及陽性藥組中小鼠膝關節軟骨中的MMP-13表達相較于模型組均有明顯下降，其中陽性藥組小鼠膝關節軟骨中的MMP-13表達最低，接近于假手術組的水平。低劑量組、高劑量組、陽性藥組的MMP-13表達呈遞減趨勢。該部分實驗表明，中藥復方溫經通絡湯在治療KOA的過程中，可有效降低MMP-13的表達，MMP-13不僅可以降解軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白，還可以降解軟骨中的蛋白多糖，IV型和X型膠原蛋白，骨黏連蛋白和基底膜蛋白聚糖，其在KOA中扮演著重要角色[2]。而溫經通絡湯可以通過抑制MMP-13的表達，從而達到維持膝關節內生理環境的平衡，進一步延緩膝關節內關節軟骨的退變。見圖4、圖5和表3。

圖4 免疫組化檢測各組小鼠膝關節軟骨中MMP-13的表達(×400)

圖5 小鼠膝關節軟骨中的MMP-13表達比較

造模成功并干預2周后，模型組小鼠膝關節軟骨中的HIF-1α含量相較于假手術組有明顯升高(P<0.01)，高劑量組、低劑量組及陽性藥組小鼠膝關節軟骨中的HIF-1α含量均高于假手術組且低于模型組(P<0.05)。低劑量組、高劑量組及陽性藥組小鼠膝關節軟骨中的HIF-1α含量呈遞減趨勢(P<0.05)。該部分實驗證實，中藥復方溫經通絡湯在治療膝關節骨性關節炎過程中，可有效抑制關節表面軟骨內HIF-1α的表達，由于VEGF是HIF-1α調節的靶基因，所以溫經通絡湯可通過抑制HIF1α的表達，從而達到減緩血管新生的目的。見圖6、圖7和表3。

圖6 小鼠膝關節軟骨中的HIF-1α表達比較

圖7 免疫組化檢測各組小鼠膝關節軟骨中HIF-1α的表達(×400)

4 討論

溫經通絡湯是黃桂成教授結合數十年臨床經驗，經過不斷調整、優化后總結出的經驗方。方中附子、桂枝溫經散寒、通絡止痛；熟地黃養血滋陰、生精益髓；土茯苓、澤瀉利水除濕解毒、通利關節；陳皮化痰理氣；膽南星熄風定痙；延胡索活血行氣止痛；全蝎、蜈蚣搜風通絡、熄風止痛、解毒散結；懷牛膝引藥下行，補肝腎、強筋骨；甘草調和諸藥。此方針對膝骨關節炎的致病因素，從風、寒、濕三邪入手，以祛風、散寒、化濕等為治療原則，以溫經散寒，搜風通絡為治療方法，在臨床應用中取得了立竿見影的效果。

膝骨關節炎屬于骨痹范疇，如《素問·靈樞》[3]曰：“痹在于骨則重……在于筋則屈不伸。”膝骨關節炎是影響中老年人群工作生活的常見病癥，其主要癥狀包括局部疼痛，活動受限，關節腫脹、變形等。該疾病的發生發展過程中伴隨著軟骨的破損、增生、缺失等一系列的病理改變[4]，在發生病變的軟骨中血管侵襲起到了不可忽視的作用，新生血管可進一步加重軟骨結構的破壞，而血管生長因子(VEGF)則起到了促進血管新生的作用，因此通過抑制VEGF的表達，可有效減緩軟骨內血管侵襲的速度，從而達到保護軟骨形態，減輕膝骨關節炎癥狀的效果[5]。骨關節炎機制研究中發現，血管侵襲是軟骨破壞的始動環節，早期抑制血管侵襲可以阻止骨關節炎發展[6]。軟骨組織受刺激分泌血管內皮生長因子(VEGF),早期誘導內皮細胞增殖并向軟骨區定向移動，軟骨組織受刺激分泌基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)等蛋白酶，進一步為血管侵襲開辟組織間隙[7]。VEGF可能是炎癥新生血管的關鍵調節因子，VEGF誘導內皮細胞增殖遷移和刺激血管生成[8]。Cécile Lambert等[9]研究膝關節骨性關節炎的滑膜組織標本16例，通過組織學和免疫組化實驗，滑膜細胞分離培養、DNA分析以及IL-6、IL-8、VEGF、TSP-1和VEGI的免疫測定，對不同程度的滑膜血管生成和炎癥關系進行研究。免疫組化研究顯示KOA滑膜的內皮細胞密度和VEGF免疫反應性增加，對應著炎癥級別和巨噬細胞浸潤增加。TSP-1作為血管生成抑制劑，過表達會降低炎癥和血液滑膜血管密度。巨噬細胞在內皮的遷移是血管生成的關鍵步驟之一。巨噬細胞通過促血管生成因子和細胞外基質重塑促進血管生成。Tibesku等[10]建立了前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)切斷的兔膝關節KOA模型，提取關節軟骨進行組織學和免疫組化研究。實驗顯示KOA關節軟骨細胞內VEGF 高表達。Lambert 等[11]采集了接受全膝關節置換術(total Knee Arthroplasty, TKA)的KOA 患者的滑膜組織，檢測VEGF 在內的多種細胞因子水平。實驗證實VEGF 和 KOA 的發生及進程密切相關。Saetan 等[12]和Hoff 等[13]采集KOA 患者的組織液：血漿、膝關節液、滑膜和軟骨，并檢測各種細胞因子水平。實驗證實關節液和滑膜組織中，包括VEGF在內的多種 PIC 水平相較于血漿顯著升高。Chen等[14]將大鼠關節軟骨細胞以單層培養，通過RT-PCR和WB實驗，表明VEGF可能通過抑制聚集蛋白聚糖和II型膠原的合成和表達而導致關節軟骨退化。VEGF 是血管生成的重要參與者，是血管內皮細胞形成的啟動者。VEGF 的表達受多個基因的調控，HIF-1α是調控VEGF表達最主要的基因[13]。

通過以上的實驗結果可以看出溫經通絡湯可有效抑制HIF-1α的表達，從而進一步調控VEGF的表達，延緩血管侵襲軟骨的進程，以達到減輕炎癥反應，減緩軟骨退化，修復軟骨缺損，維持軟骨完整性，改善關節生理功能的目的。