復脾湯對STZ模型大鼠血糖、LEP、INS及脂肪因子Apelin、vaspin的影響

張超

(河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由于遺傳和環境因素引起的一組以高血糖為特征的臨床綜合征[1]。是胰島素缺乏或(和)胰島素作用障礙等引起的糖類、脂肪和蛋白質等的代謝紊亂，其臨床表現為多飲、多尿、多食以及消瘦等[2-3]。目前研究認為，脂肪組織不僅作為儲藏能量的人體組織，而且可作為能在機體生命代謝中起關鍵性作用的組織器官[4]。脂肪組織能夠分泌相關因子，并以內分泌、旁分泌等途徑參與機體的生理功能，調節糖脂代謝平衡，維持內環境的穩定[5]。因此，本研究擬通過檢測血糖(FBG、2hBG、14dBG)、血脂(TG)、胰島素(INS1、INS2)、脂肪因子(LEP)以及新型脂肪因子(Apelin、vaspin)指標的表達，分析脂肪因子與糖尿病發病的分子機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性普通級Wistar大鼠，3月齡，體質量(200±30)g，由鄭州大學醫學院動物實驗中心提供。飼養條件為一級環境條件下飼養,溫度控制在20 ℃～28 ℃,控光(12 h明暗相間),自由飲水、采食。

1.2 藥品、試劑及儀器

1.2.1 藥品

復脾湯藥物組成：人參10 g，黃芪12 g,茯苓12 g，五味子12 g，山藥12 g，麥冬10 g，葛根10 g，天花粉10 g，雞內金12 g，炒麥芽10 g和炒神曲10 g。由河南中醫藥大學第三附屬醫院提供藥材和代煎，湯劑濃度:相當于生藥1 kg/L。二甲雙胍(0.5 g/片，批準文號：國藥準字H20041986，北京萬輝雙鶴藥業有限責任公限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)。

1.2.2 試劑

大鼠瘦素(LEP)酶聯免疫吸附測定試劑盒(貨號：E-EL-R0582c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；大鼠胰島素(INS)酶聯免疫吸附測定試劑盒(貨號：E-EL-R2466c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；大鼠內臟脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(vaspin)酶聯免疫吸附測定試劑盒(貨號：E-EL-R1066c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；大鼠Apelin(APLN)酶聯免疫吸附測定試劑盒(貨號：E-EL-R2413c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2.3 儀器

One Touch強生血糖儀(強生(中國)醫療器材有限公司)；全自動生化分析儀(Chemray型，Rayto公司)；微型高速離心機(C2500-R-230V型，美國Labnet有限公司)；電熱恒溫培養箱(ICV-450型，日本ASONE有限公司)；全自動酶標儀(Multiskan MK3型，Thermo scientific有限公司)。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立

40只Wistar大鼠均適應性喂養2周后，按體質量隨機選取10只大鼠作為空白組。空白組繼續給予普通飼料喂養。剩余30只大鼠給予高糖、高脂飼料喂養。高糖、高脂飼料喂養4周后禁食，不禁水12 h，稱取大鼠體質量。高糖高脂組按35 mg/kg腹腔注射1.75% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，空白組按同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。

檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制：取2.1 g檸檬酸加入100 mL雙蒸水，配制成0.1 mmol/L A液，取2.94 g檸檬酸鈉加入100 mL雙蒸水，配制成0.1 mmol/L B液。取28 mL A液與22 mL B液混合，用雙蒸水定容至100 mL，用pH試紙測pH值為4.2～4.5，即為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，臨用前10 min配制。1.75% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制：取700 mg STZ 溶于40 mL上述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，即可配制成 1.75% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，現用現配，配制過程防潮，配制后30 min內用完。

STZ注射72 h后，所有大鼠禁食不禁水12 h，20%葡萄糖溶液按照2.0 g/kg劑量灌胃以測 OGTT。斷尾法取血，One Touch強生血糖儀分別測該組大鼠空腹血糖(FBG)、OGTT后2 h血糖(2hBG)，酶聯免疫法測空腹胰島素(FINS)。取FBG≥7.8 mmol/L或血糖峰值≥16.7 mmol/L的大鼠為造模成功大鼠。本試驗建模存活率為96%,穩定成模率為75%。

2.2 動物分組及給藥

將造模成功的大鼠采用高脂、高糖飼料并隨機分成復脾湯組10只、二甲雙胍組10只、模型組10只和正常組10只。造模2周后進行藥物干預，模型組和正常組均用生理鹽水(每1 kg體質量10 mL)灌胃；二甲雙胍組是用二甲雙胍懸浮液按每1 kg體質量0.089 g灌胃；復脾湯組使用復脾湯煎劑，按每1 kg體質量14.2 g的劑量灌胃。

2.3 標本采集

用藥6周后，大鼠空腹狀態下用麻醉藥(20%烏拉坦)進行腹腔麻醉,進行主動脈采血，采用離心機離心(3 000 r/min)20 min后，收取上清液，將上清液存于-80 ℃冰箱，待指標檢測。

2.4 指標檢測

采用生化法檢測FBG、2hBG、14dBG和TG；酶聯免疫吸附實驗法(Elisa法)檢測LEP、INS、vaspin和Apelin指標的表達。

2.5 檢測方法

2.5.1 FBG、2hBG、14dBG和TG檢測方法

采用全自動生化儀進行檢測。

2.5.2 LEP、INS、vaspin和Apelin指標檢測方法

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。1)加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL。給酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min。2)棄去孔內液體，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗體工作液100 μL(在使用前20 min內配制)，給酶標板加上覆膜，37 ℃溫育1 h。3)棄去液體，洗板3次，每次浸泡30 s，大約350 μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。4)每孔加酶結合物工作液(臨用前20 min內配制，避光放置)100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育30 min。5)棄去孔內液體，甩干，洗板5次。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 復脾湯對各組大鼠FBG、2hBG、14dBG和TG的影響

與對照組比較，治療后復脾湯組和二甲雙胍組FBG、2hBG、14dBG和TG指標均低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；復脾湯組與二甲雙胍組比較，FBG、2hBG、14dBG和TG指標均高于二甲雙胍組，兩組BG、2hBG、TG指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，14dBG指標比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3.2 復脾湯對各組大鼠INS的影響

與對照組比較，治療后復脾湯組和二甲雙胍組INS1升高，INS2表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復脾湯組INS1、INS2變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠INS的變化

3.3 復脾湯對各組大鼠LEP、Apelin、vaspin的影響

與對照組比較，復脾湯組和二甲雙胍組LEP、Apelin、vaspin表達均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。從復脾湯組和二甲雙胍組LEP、Apelin、vaspin表達情況比較，變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠LEP、Apelin、vaspin的變化

4 討論

糖尿病屬于“消渴”范疇。歷代醫家對消渴的研究認為，病機以腎陰虛為本，燥熱為標，分上、中、下三消論治[6]。消渴的發病雖與肺、脾、腎等多臟器失調相關，但其首發于脾胃，久則影響三焦，脾胃功能的失調是消渴發生、發展的重要因素[7]。脾、胃位中焦，兩臟燥濕相濟，陰陽相合，升降相因相輔為用。脾胃為后天之本，氣血生化之源。脾主運化、升清，胃主受納、腐熟水谷，共同完成飲食水谷的消化吸收。若脾失健運，郁而化熱，則多食易饑[8]。脾虛不能散精，則肺失所養，肺陰不足，津液無以輸布則成干渴。脾為胃行其津液，若脾陰不足，胃火亢盛，則多飲多食。糖尿病患者雖多飲多食，但多形態消瘦，究其病因與脾體合肌肉，主四肢的功能失調相關[9]。若脾運失健、肌肉失養而形體消瘦。脾胃虛弱，升清降濁失常，精微隨濁陰之氣下流而尿量增多，混濁如脂膏、味甜[10]。脾氣虧虛，健運失職，“游溢”乏力，是糖尿病血糖升高及諸癥萌生的源泉。

復脾湯是根據脾虛“不及游溢”的消渴病基本病機，具有健脾和胃消積養陰之功用。方中多為藥食同源之中藥，無明顯不良反應。方中人參味甘，有大補元氣、生津止渴、調榮養衛的功能；黃芪味甘，健脾益氣、扶正固本的功效；五味子酸澀，滋腎水、納元氣，既能生津又可澀精的作用；山藥甘平，益氣養陰、生津止渴，能平補肺、脾、腎三臟之氣；麥冬具有生津潤肺、養陰清熱的功能；葛根升清降濁、有生津化液止渴之功，能促進營津上升，精氣布散，鼓舞胃氣上行而生陰液；天花粉味甘性涼，養胃陰，瀉瘀火，善于清熱生津、消腫排膿，乃“消渴圣藥”；雞內金消積滯、健脾胃。該方切合消渴病的基本病機，臨床療效顯著。

目前研究認為，糖尿病的發病與胰島素缺乏或(和)胰島素作用障礙關系密切相關。胰島素功能失調會導致糖類、脂肪和蛋白質等代謝紊亂，脂肪組織不再僅僅作為儲藏能量的人體組織，而在機體生命代謝也起關鍵性作用[11]。脂肪組織分泌的多種激素如瘦素、脂聯素、抵抗素及細胞因子等，能調節糖脂代謝平衡，維持內環境的穩定[12-15]。因此，本研究認為糖尿病與糖脂代謝失衡關系密切。

瘦素(LEP)是由脂肪細胞分泌的脂肪因子，也是人體自身調節的產物，并且對胰島素有雙向調節作用[16-17]。因此，LEP能調節血糖。Apelin和vaspin為一種新型脂肪因子，在脂肪組織中大量表達。Apelin與糖尿病的發生、發展，以及糖尿病抵抗等方面均有重要作用。目前研究認為，糖尿病患者vaspin指標的升高可能是胰島素水平降低的一種代償反應，但其與糖代謝的關系然不明確[18]。本研究通過對STZ模型大鼠LEP、Apelin、vaspin指標檢測發現：模型組、復脾湯組和二甲雙胍組LEP、Apelin、vaspin指標均升高，與模型組比較，復脾湯組和二甲雙胍組均有統計學意義(P<0.05)。

目前研究認為，糖尿病與肥胖的病理基礎相同，其疾病的發生與胰島素抵抗相關。因一些脂肪因子可促進胰島素抵抗的發展，故成為目前研究的熱點。有研究[19]認為，新型脂肪因子(Apelin、vaspin)可增加胰島素的敏感性。二甲雙胍是治療2型糖尿病的常用藥物，有促進胰島素分泌的作用[20]。因此本研究選用二甲雙胍為陽性對照組，結果表明，復脾湯與二甲雙胍對STZ模型大鼠均有較好的治療效果。復脾湯是中藥制劑，無二甲雙胍惡心、腹部不適、腹瀉皮疹、蕁麻疹等不良反應。

本研究基于中醫基礎理論“脾主散精”理論，以“脾虛不及游溢”為切入點，觀察具有健脾益氣功效的復脾湯對大鼠血糖、TG、INS、LEP及新型脂肪因子Apelin、vaspin血清水平的影響，以探明復脾湯治療糖尿病的生物學機制,并驗證“脾主散精”理論，從而證實糖尿病患者存在“脾氣虛”的病理狀態，為中醫從脾論治糖尿病提供可靠依據。