高頻重復經顱磁刺激對大鼠工作記憶局部場電位和鋒電位時頻特征的影響

1.河北工業大學電氣工程學院，a.省部共建電工裝備可靠性與智能化國家重點實驗室；b.天津市生物電工與智能健康重點實驗室，天津市 300130

經顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation,TMS)是一種無創、無痛、易于操作的非藥物干預生物刺激技術，它利用時變磁場產生感應電場，引起生物電流在組織中傳導，改變大腦皮質神經細胞的動作電位，從而影響腦內代謝和神經電活動[1]。近年來，TMS在研究神經生理學、認知神經科學、神經調控以及各類神經精神類疾病的治療方面被廣泛關注和應用，成為新世紀腦科學研究的重要技術手段之一[2]。不同模式TMS 的刺激效果有所不同，重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)能通過調節頻率、強度、時長等刺激參數進行綜合調控以取得最佳效果，目前已被用于多種精神類疾病以及認知功能的研究中[3-4]。目前研究表明，rTMS 能改善阿爾茨海默病患者的學習記憶障礙和精神行為異常等癥狀[5-6]。rTMS 可分為≤1 Hz 的低頻rTMS 和>1 Hz 的高頻rTMS，不同的刺激頻率對生物體的影響也不盡相同[7]。向艷平等[8]發現高頻rTMS 刺激可促進不完全性脊髓損傷大鼠運動功能恢復。吳越等[9]研究1 Hz 和20 Hz rTMS對阿爾茨海默病患者認知功能的影響，也證明高頻組療效優于低頻組。以上研究初步證明高頻rTMS調控神經的有效性，但目前關于高頻rTMS對神經電生理機制調控的研究較少。

工作記憶(working memory)是指在執行學習、理解、問題解決等復雜認知任務過程中，短時間內保存和處理信息的系統[10]。前額葉皮質(prefrontal cortex,PFC)的損傷會削弱各種哺乳動物執行工作記憶任務時的表現，表明PFC 在工作記憶中起著重要作用。現有的研究證明PFC 中持續的神經元活動在調節工作記憶中起著重要作用[11-15]。工作記憶障礙是阿爾茨海默病的常見癥狀之一，高頻rTMS 能提高神經興奮性，在一定程度上調節大腦神經元電活動，達到改善腦功能的目的[16-17]，將其用于治療工作記憶障礙能取得一定的效果，但TMS 調控具體腦區神經電活動的機理仍不清楚。因此，針對不同的刺激條件，研究神經系統功能實現過程中神經元電活動特征模式發生的變化對研究神經調控機理具有重要意義[18]。通過在體植入式微電極陣列可以采集到清醒動物在認知活動過程中相關腦區的兩種電活動信號：局部場電位(local field po-tentials,LFPs)和鋒電位(spike)。對LFPs 和spike 進行分析能將神經活動與認知行為聯系起來，包括感覺刺激編碼、知覺結合、注意力和工作記憶[19-22]。

本文主要研究高頻rTMS 對大鼠工作記憶行為學和神經電活動的影響，通過運用在體植入式微電極陣列記錄技術，采集執行工作記憶任務的大鼠PFC 腦區中的LFPs 信號和spike 信號，對比分析高頻rTMS 對大鼠行為學及神經電生理信號LFPs 和spike 的影響，為深入探究TMS調控神經活動的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

成年雄性Wistar 大鼠8 只，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK(京)2016-0006。準備10%水合氯醛溶液、鑷子、剪刀、義齒基托樹脂粉、義齒基托樹脂液、棉球、消毒酒精等實驗用品。

本研究經河北工業大學生物醫學倫理委員會審核通過(No.HEBUTaCUC2019004)。

1.2 實驗設備

Rapid2 磁刺激設備，選用“8”字形線圈：英國MAGSTIM 公司。51670 腦立體定位儀： 美國STOELTING 公司。16 通道微電極陣列(2×8)、OmniP-lex/128在體多通道神經信號采集系統：美國PLEXON公司。

1.3 實驗設計

選取Wistar 大鼠PFC 作為目標腦區，基于磁刺激儀等動物實驗的刺激系統制備rTMS 刺激組大鼠，通過手術植入16 通道微電極陣列，然后利用“T”形迷宮進行工作記憶行為學訓練。通過記錄電極采集rT-MS刺激組和對照組在執行工作記憶任務時PFC中LF-Ps 信號和spike 信號的變化情況，初步探討高頻rTMS對大鼠工作記憶過程中神經電活動的調控作用效果。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物準備

將8 只Wistar 大鼠隨機分為對照組和刺激組，每組4只。刺激組固定在大鼠限制器中，將“8”字形線圈放置在大鼠頭皮上，利用腦立體定位儀標定PFC 大致區域，將線圈刺激點定位在該點。調節磁刺激設備的刺激頻率為5 Hz、強度為100%運動閾值。rTMS共持續14 d，每天600 個脈沖刺激。600 個脈沖分為24串，串間隔2 s，每串包括25 個5 Hz 的單脈沖刺激。對照組未進行rTMS。

所有大鼠在進行“T”形迷宮訓練之前手術植入16通道微型電極。根據大鼠腦立體定位圖譜，將電極植入前囟前2.5～4.5 mm、旁開0.2～1.0 mm、深2.5～3.5 mm處的目標腦區，在微電極陣列推進至腦組織過程中，對神經元電活動信號進行持續監控。手術完成后，大鼠單獨飼養3 d 使其身體恢復，然后進行以下實驗。

1.4.2 “T”形迷宮工作記憶訓練過程

“T”形迷宮見圖1。將大鼠放置在起始位置A 點，同時在B、C 食槽上放入獎勵食物。讓大鼠自由選擇到達B 或C 點，可獲得1 次食物獎勵，待其進完食又會回到A 點。經過5 s 延遲后，大鼠重新從A 點出發，開始延時交替選擇。如果第2 次選擇的方向與第1 次相反，大鼠就能再次得到食物獎勵，這兩次選擇構成一次完整的工作記憶實驗。在一次工作記憶實驗中，若大鼠能得到2 次食物獎勵則記為一次正確實驗，否則記為錯誤。完成1 次實驗任務后，無論大鼠是否正確執行都讓其回到起始點，開始下1 次工作記憶任務實驗。每天對大鼠進行兩組“T”形迷宮工作記憶任務訓練，每組包含10 次實驗。當大鼠執行“T”形迷宮工作記憶任務正確率連續兩天在80%以上時，認為其達到行為學正確率標準。

圖1 “T”形迷宮

1.5 數據采集及處理

在大鼠執行工作記憶任務實驗過程中，將大鼠頭部的微型電極陣列與多通道信號采集系統連接，實時記錄PFC 多通道神經電信號。原始數據采樣頻率為40 kHz，LFPs 采樣頻率為1 kHz，將所獲取的信號經過0.3～500 Hz 的低通濾波，得到兩組原始LFPs 信號。經過300～7.5 kHz 高通濾波、閾值檢測，再經過主成分分析得到spike 序列。圖2 為實驗中記錄的LFPs 和spike信號的示例。

1.5.1 工作記憶過程中LFPs和spike分析

隨機選取每只大鼠達到行為學正確率標準后的20次工作記憶任務過程中的LFPs 信號，進行時頻分析。將采集到的多通道LFPs 信號導入Matlab R2014a(MathWorks,USA)進行數據分析處理。依照選定的行為學參考點作為每次試驗的時間原點，截取時間原點前500 ms 和后500 ms 共1000 ms 的LFPs 段，利用Matlab 對多次實驗的數據進行處理。由于θ 振蕩(4～12 Hz)與工作記憶等短時記憶行為密切相關[23]，而γ振蕩(30～80 Hz)也是與信息的存儲和提取密切相關的神經電活動，是工作記憶中呈現的重要神經振蕩之一[24]。因此將4 只大鼠共80 次工作記憶任務過程中的LFPs信號進行短時傅里葉變換，然后進行時頻功率譜分析，得到80 個試驗的平均時頻功率譜，分析其θ 頻段和γ頻段的動態功率變化。

圖2 LFPs和spike信號示例

將采集到的16 通道原始信號導入Offline Sorter軟件進行spike 信號篩選和分類，得到具有代表性的發放神經元的spike 信號，將得到的spike 信號導入Neu-roExplorer 軟件中，得到執行工作記憶任務時的spike序列和平均spike 發放速率圖。已有研究表明，spike發放速率與行為學能力之間存在密切聯系[25]。所以本文采用速率直方圖分析處理兩組大鼠PFC 腦區spike發放數據。平均發放速率圖是通過將多個速率直方圖疊加平均實現的。對每個數據段內出現的spike 進行計數，得到單位時間內的動作電位發放率。以行為學參考點為時間原點，[-2,1]為窗長，將工作記憶實驗中spike 信號截取出n 個數組，即每個數組對應δ 時間內spike 信號，ki為第i 個時間窗內spike 個數，計算該數組內spike 發放率r(ⅱ)=ki/δ，可得工作記憶實驗中spike速率直方圖，對多組速率直方圖疊加平均，對比兩組中平均spike發放率。

1.5.2 Multitaper頻譜估計

有研究表明，LFPs 信號和spike 信號在工作記憶過程中具有協同編碼的現象[26]，本文應用常見時頻處理方法之一的頻譜相干分析來對比不同組別的大鼠在工作記憶過程中LFPs-spike 信號同步化的差異。本研究選取的窗函數是由5 個帶寬為400 ms、相互正交獨立的離散正交扁球序列(discrete prolate spheroidal se-quences,DPSS)組合而成(圖3)，選取步長為50 ms，將窗口滑動進行計算，就得到LFPs-spike 信號動態頻譜相干值。

取時間長度[0,T]的LFPs 信號和spike 信號序列分別為X={xj}和Y={yj}(j=1,2,…,N)，對X 進行加窗傅里葉變換，如公式(1)所示：

圖3 DPSS窗函數示意圖

選取典型通道LFPs 信號和spike 信號，計算每次試驗的自譜Sx(f)、SY(f)和互譜SXY(f)，然后計算X和Y在一個窗口中的頻域相干函數CXY(f)，移動窗口，獲得CXY(f)與時間之間的函數，記為：

式中的、SX(f,t)、SY(f,t)、SXY(f,t)分別是同一個通道信號X和Y的Multitaper 頻譜估計的自譜和互譜，CXY(f,t)是兩個信號在頻率f處、時間t處的相干值，該值在0 到1 之間。信號X 和Y 的同步化程度越高，CXY(f,t)的數值趨向于1。

1.6 統計學分析

采用SPSS 20.0 進行統計學分析。計量資料呈正態分布，以()表示，采用配對t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 工作記憶行為學正確率

對照組達到正確率標準的時間分別為6 d、10 d、10 d、10 d，平均(9±1.73)d；刺激組分別為2 d、7 d、7 d、8 d，平均(6±2.34) d，少于對照組(t=2.51,P=0.046)。

2.2 LFPs時頻特征和spike發放率

刺激組θ 頻段能量較對照組提高，并在工作記憶行為學參考點前較為集中。見圖4。

對照組工作記憶實驗過程中LFPs信號的θ頻段能量波動不大且處于較低水平，刺激組工作記憶實驗LFPs 的θ 頻段能量在行為學參考點前較高且比較集中。見圖5。對照組行為學參考點前后0.5 s 內平均能量為(1.4179±0.3371) mV2，刺激組為(2.5619±0.6705)mV2，顯著大于對照組(t=12.49,P<0.001)。

γ 頻段能量分布較為平均且明顯低于θ 頻段能量，且刺激組LFPs 信號的γ 頻段整體能量高于對照組。見圖6。

工作記憶過程中，兩組LFPs信號的γ 頻段能量分布都比較均勻，但刺激組能量始終高于對照組。見圖7。對照組行為學參考點前后0.5 s 內的平均能量為(0.2674±0.0326) mV2，刺激組為(0.3478±0.0290) mV2，顯著大于對照組(t=15.23,P<0.001)。

spike信號在行為學參考點前密集發放，推測此時PFC 腦區神經元處于活躍狀態，刺激組工作記憶中發放神經元更加活躍。隨機選取每只大鼠正確執行“T”形迷宮工作記憶實驗時延遲交替階段spike信號20段，對照組和刺激組分別為80 段數據。計算得到80 段對照組數據平均spike發放率為(21.27±6.37)脈沖/s，刺激組為(31.59±8.10)脈沖/s，刺激組高于對照組，但無顯著性差異(t=1.73,P=0.067)。見圖8、圖9。

2.3 LFPs-spike時變頻譜相干

隨機選取兩組在80次工作記憶過程中典型通道的LFPs 信號和spike 信號進行分析，得到在行為學參考點前2 s 到后1 s、0～100 Hz，LFPs-spike 的Multitaper頻譜相干的時頻分布圖(圖10)。兩組相干值在工作記憶行為學參考點前1 s 開始增大，且集中在參考點前后，θ 頻段相干值增加幅度更大，刺激組整體相干值高于對照組。

圖4 兩組工作記憶實驗時LFPs信號中θ頻段平均時頻分布

圖5 兩組工作記憶實驗中LFPs的θ頻段平均能量

圖6 兩組工作記憶實驗時LFPs信號中γ頻段平均時頻分布

圖7 兩組工作記憶實驗中LFPs的γ頻段平均能量

圖8 spike序列圖

圖9 兩組平均spike速率直方圖

圖10 兩組工作記憶LFPs-spike平均Multitaper頻譜相干分布圖

行為學參考點前后1 s內，刺激組θ頻段平均相干值(0.6809±0.0858)顯著大于對照組(0.5786±0.0713)(t=8.82,P <0.001)；γ 頻段平均相干值(0.5259±0.0300)顯著大于對照組(0.4553±0.0394)(t=13.43,P<0.001)。

3 討論

本研究顯示，刺激組較對照組更快地學會“T”形迷宮工作記憶實驗，說明高頻rTMS 可有效提升大鼠工作記憶行為學能力。關于提升作用的時效性，以及這種時效性是否與高頻rTMS 的其他參數有關，有待進一步研究。

LFPs 信號的θ 頻段和γ 頻段是工作記憶的重要特征頻段[27]。本研究顯示，θ 頻段在工作記憶過程中起主要作用，γ 頻段次之。高頻rTMS 能提高LFPs 信號的θ 頻段和γ 頻段能量，提升工作記憶中行為學參考點前LFPs信號θ頻段集中程度，同時增強大鼠工作記憶中LFPs-spike 信號的協同編碼過程，實現對腦功能活動的調控并影響大鼠的行為學能力。另外，高頻rTMS還能增強工作記憶中的γ振蕩。

Spike 信號是分析神經電活動機制最直接的途徑之一[28]，但目前受限于在體多通道技術手術難度、電極質量、數據采集與分析的困難等因素，直接對spike信號的分析并不多見。本文列出一次典型工作記憶中的spike 序列圖和兩組大鼠平均spike 速率直方圖，可以觀察到spike 發放在工作記憶行為學參考點前比較集中，且高頻rTMS 后spike 平均發放率并無顯著性差異，可能與大鼠數量過少有關，有待進一步完善。

為了避免分析單一模態神經信號的缺陷，本文將采集到的兩種模態電信號進行Multitaper 頻譜相干分析，結果顯示高頻rTMS 能在一定程度上提升大鼠工作記憶實驗中θ 頻段和γ 頻段LFPs-spike 的同步化程度，這也印證了前文LFPs信號的功率譜分析結果。

本文為探究TMS 作用對大腦認知功能的影響及其機制提供了參考，后續的研究將圍繞不同參數TMS作用后各種神經電信號的聯合分析展開。

利益沖突聲明：本文所有作者聲明不存在利益沖突。