濾除自然光中UV-B輻射成分對杜仲光合和次級代謝產物的影響

李德文，杜丹丹，季倩如，郭曉瑞，劉 英，于雪瑩，唐中華

（東北林業大學 a.森林植物生態學教育部重點實驗室；b.化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

紫外線-B（UV-B）輻射是太陽輻射光譜中一個非常重要的組成部分，極易受多種因素的影響[1]。近年來，一些人為污染物，如氯氟化碳化合物（CFC）和其他拮抗劑等，嚴重破壞了大氣平流層中的臭氧（O3），導致地球表面UV-B（波長280 ～315 nm）輻射強度不斷增加。有研究結果表明，大氣平流層中臭氧每減少1%，到達地球表面的太陽紫外線輻射就會增加2%[2]。盡管到達地球表面的UV-B 輻射強度大約僅占太陽短波輻射的1.5%，但由于其能被一些核酸、蛋白質等生物大分子有效吸收，地球生態系統中的生物尤其是高等植物的生長發育會遭到嚴重干擾。自然條件下，環境UV-B 輻射強度增加會對植物的生長、形態特征、生理生化過程、基因表達、抗氧化酶活性及次級代謝產物含量等產生嚴重影響[3]。今后較長一段時間內，陸地上的生物將繼續受到太陽UV-B 輻射的影響，因此，揭示UV-B 輻射對生態系統中動植物的影響，并制訂相關的有效舉措，將會成為研究者關注的焦點。

光合作用是植物重要的生理代謝反應之一，也是植物形態建成的基礎。光合機構是UV-B 輻射的中心靶點。UV-B 對光合作用的影響主要包括光系統Ⅱ（PS Ⅱ）反應中心失活、類囊體膜系統損傷及光合色素含量下降等[4]。Jansen 等[5]認為，植物對UV-B 輻射的響應機制是脅迫、修復和馴化三者之間綜合平衡的結果，在光修復過程中，可見光和UV-A（315 ～400 nm）能激活光復活酶，并分解經紫外線照射而形成的嘧啶二聚體，使UV-B 輻射造成的DNA 和蛋白質等大分子物質損傷得以修復。馴化是指給予植物一定的非致死的脅迫處理，植物體會產生一些可遺傳的行之有效的防御策略來應對隨之而來的更惡劣的逆境，與未經馴化的植物相比其抗逆性更強，這種現象像是植物具有了對脅迫的“記憶力”或者印記。馴化過程中植物體可產生一些有益的生物化學物質，如何鳳等[6]發現經過低溫馴化后杜仲花芽抗氧化物質和酶活性均顯著增加。不同作物對UV-B 輻射的響應機制有明顯差異，有些物種能被UV-B 輻射刺激而產生抗性，有些則非常敏感。

杜仲Eucommia ulmoides，別名思仙、思仲、玉絲皮棉等，是中國珍稀瀕危孑遺樹種，具有重要的藥用價值和經濟用途，是中國特有的十分重要的戰略資源樹種[7]。野生杜仲在我國亞熱帶至溫帶的27 個省（區、市）均有栽培，由于其適應性強，現已被廣泛引種到亞洲、歐洲和北美洲等地區[8]。但杜仲栽培生境差異較大，各地引種杜仲長勢明顯不同，尤其高UV-B 輻射地區杜仲生長受到抑制，光合速率和部分紫外吸收物質（如桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和綠原酸）的含量等顯著降低[9]， 因此對杜仲培育技術及栽培生理進行深入研究具有重要的現實意義。本研究中以藥用植物杜仲為材料，在自然光輻射背景下，通過濾除UV-B 輻射，研究UV-B 輻射對杜仲光合系統的影響，并結合光合色素和次級代謝產物的變化，探討了杜仲對自然環境中UV-B 組分的適應性，以期為杜仲的定向生態培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗樣地位于哈爾濱市東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室溫室內。哈爾濱市地處中國東北平原東北部地區，黑龍江省南部，位于東經125°42′～130°10′、北緯44°04′～46°40′，屬中溫帶大陸性季風氣候，冬長夏短，四季分明，全年平均降水量569.1 mm，年平均溫度3.6 ℃，集中降水期為每年7—8月，集中降雪期為每年11—1月（次年）。

1.2 植物材料和栽培條件

試驗材料為3年生杜仲盆栽實生苗，常規水肥管理。栽培土壤有機碳、氮、磷含量分別為(571.11± 38.48)、(24.92±0.98)、(2.35±0.25) g/kg。

1.3 試驗方法

1.3.1 自然光中UV-B 輻射成分的濾除

濾除自然光譜中UV-B 輻射成分的模擬試驗主要參照Flint 等[10]的方法，并略有改進。可移動的樣方框架采用三角鋁材制作，頂部為長方形，長220 cm，寬120 cm，高180 cm。在框架上端覆蓋Mylar 型Luminar 薄膜（Toray，日本），厚度 0.08 mm，可濾除自然光譜中絕大部分UV-B 成分。在膜下部留80 cm 高度，以便風和雨水通透，在覆膜頂部留出直徑為0.6 cm、孔距為20 cm×20 cm 的小孔。分別覆蓋1 層膜（T1 處理組）和2 層膜（T2處理組）模擬不同程度UV-B 濾減，以自然環境處理（不減弱UV-B）作為對照（CK）。每處理20盆，各設3 個重復。各處理的UV-B 輻射劑量濾除率如圖1 所示，各處理的UV-B 平均濾除率分別為51.64%和80.68%。2017年6月23日開始處理，處理時間為每天9:00—16:00，根據天氣情況等略有調節，并分別于處理進行22 和41 d 時取樣。

圖1 各處理的UV-B 輻射劑量和UV-B 濾除率Fig.1 UV-B radiation dose of each treatment and UV-B filtering proportion of T1 and T2 treatment groups

1.3.2 光合參數和光合色素含量的測定

于晴天9:30—11:00，選取植株已完全展開的生長狀況、葉齡和葉位一致的葉片，采用Li-6400型便攜式光合儀測定供試植株凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。按照董曉穎等[11]的方法計算水分利用效率（EWU）、葉片羧化效率（EC）和氣孔限制值（Ls）。

式中：Ca表示大氣CO2濃度，為400 μmol/mol。

參考Cen 等[12]的方法，使用便攜式PAM-2500葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數，并根據Yao 等[13]的方法計算PS Ⅱ最大光合效率（Fv/Fm）、PS Ⅱ實際光合效率（ΦⅡ）和電子傳遞速率（RET）。

參考魏曉雪[14]的方法測定光合色素含量。取0.05 g 葉片鮮樣，剪碎，置于試管中，加入5 mL二甲基亞砜（DMSO），黑暗條件下60 ℃水浴反應，直至樣品組織完全變白。以DMSO 為空白，使用Shimadzu UV-2550 紫外可見分光光度計（日本）分別測定提取液在480、649、665 nm 處的吸光值，并計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量及葉綠素a 和葉綠素b 含量比值。

1.3.3 次級代謝產物含量的測定

杜仲葉片次級代謝產物的提取參考Dong[15]等的方法，取1 g 葉片鮮樣置于試管中，加入8 mL色譜級甲醇于Xin-yi48 高通量組織研磨儀（寧波新藝超聲設備有限公司）中研磨震蕩（60 Hz， 2 min），使用超聲波清洗器超聲處理1 h（功率100 W，頻率40 kHz，40 ℃），震蕩混勻后使用低溫高速離心機離心10 min（8 000 r/min）。抽取上清液，在40 ℃下利用真空旋轉蒸發儀濃縮揮干，揮干后再次用甲醇復溶至2 mL，離心10 min，提取上清，密封，-20 ℃保存備用。使用0.45 μm微孔濾膜過濾，隨后采用液相色譜-質譜聯用儀進行色譜分析，C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.6 μm），柱溫25 ℃，流動相為溶劑A（62%水）與溶劑B（38%甲醇），流速為0.25 mL/min，進樣量5 μL。桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷和京尼平標準品均購于Sigma 公司，純度大于或等于98%。

1.4 數據處理

使用SPSS 19.0 和Excel 2010 軟件進行數據分析，采用單因素方差分析方法（One-way AVONA）檢驗各處理組間差異的顯著性，采用相關分析法進行各指標間相關性的分析，圖表中數值為“平均值±標準誤”。

2 結果與分析

2.1 濾除UV-B 輻射處理對杜仲葉片光合參數的影響

濾除自然光中UV-B 輻射成分對杜仲光合參數的影響如圖2 所示。由圖2 可以看出，處理22 d 時，杜仲葉片Pn和Gs隨濾除率的增加顯著降低，Ci和Tr在T1 處理組無差異，T2 處理組顯著降低（P＜ 0.05）。處理41 d 時葉片Pn、Gs和Tr顯著增加，且T2 處理組增加最大，與對照相比分別增加了61.9%、73.8%和70.1%；Ci在T1 處理組有顯著下降趨勢，在T2 處理組與對照無顯著差異（P＞ 0.05）。濾除太陽輻射光譜中UV-B 成分后，杜仲葉片Fv/Fm在2次取樣時與對照相比均無顯著差異；ΦⅡ在2 次取樣時變化趨勢相反，第1 次顯著下降，第2 次顯著上升；RET在各處理組顯著高于對照 （P＜0.05），但T1、T2 處理間無顯著差異。說明短期濾除自然光譜中UV-B 成分對杜仲葉片的光合機構產生負效應，隨著濾除時間的延長，能引起葉片穩態光化學效率的增加，并對葉片光合速率產生正效應。

濾除自然光中UV-B 輻射成分后杜仲葉片EWU、EC及Ls見表1。由表1 可知，與對照相比，處理22 d 時，杜仲葉片EWU顯著降低，T1 處理組下降幅度最大，較CK 下降了40%，EC在各處理間無顯著差異，Ls在T2 處理組顯著增加，T1 與CK 間無顯著差異（P＞0.05）。處理41 d 時，杜仲葉片EWU值與CK 相比在T1 處理組顯著上升，在T2 處理組顯著下降，EC隨UV-B 濾除率的增加呈上升趨勢，Ls在T2 處理組顯著降低（P＜0.05）。

2.2 濾除UV-B 輻射處理對杜仲葉片光合色素的影響

濾除自然光中UV-B 輻射成分對杜仲葉片光合色素的影響如圖3 所示。由圖3 可以看出，2 次取樣時間的杜仲葉片葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量有一致的變化趨勢，與CK 相比均顯著增加，且處理41 d 時葉綠素含量顯著大于處理21 d。濾除UV-B 輻射后，2 次取樣時間的杜仲葉片類胡蘿卜素含量均表現為降低的趨勢，葉綠素a 和葉綠素b含量比值在各處理間均無顯著差異（P＞0.05），但處理41 d 時其比值顯著大于處理22 d。表明長期濾除UV-B 輻射處理中杜仲葉片光合色素的含量比短期濾除處理高。

2.3 濾除UV-B 輻射處理對杜仲葉片次級代謝產物含量的影響

為了解濾除自然環境中UV-B 輻射成分對杜仲葉片主要藥用活性物質的影響，通過UPLC-Q/TOF-MS 分析收集樣品中目標化合物的代謝變化，并根據相應的標準參考化合物的質譜信息和保留時間來鑒定樣品中的目標化合物。濾除自然光中UV-B 輻射成分對杜仲次級代謝產物含量的影響如圖4 所示。由圖4 可以看出，濾除自然光譜中的UV-B 輻射后，處理22 d 時杜仲葉片次級代謝產物中京尼平、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷含量均顯著增加，京尼平苷含量呈下降趨勢。綠原酸含量在T1 處理組增加，在T2 處理組與對照無顯著差異。與對照相比，T1 處理組和T2 處理組的京尼平含量分別增加了43.5%和39.4%，京尼平苷酸含量分別增加了18.8%和6.7%。桃葉珊瑚苷含量在T1處理組與對照無顯著差異，在T2 處理組較對照增加了58.3%。京尼平苷含量在T1 處理組和T2 處理組分別下降了21.7%和51.1%（P＜0.05）。處理41 d 時，葉片中5 種次級代謝物質含量均顯著增加（P＜0.05）。與對照相比，T1 處理組和T2處理組的京尼平含量顯著增加了40.2%和30.0%，京尼平苷含量分別增加了33.3%和8.8%，京尼平苷酸含量分別增加了57.4%和23.2%，桃葉珊瑚苷含量分別增加了60.7%和65.8%，綠原酸含量分別增加了21.1%和23.7%。對比2 次取樣葉片的次級代謝產物含量發現，處理41 d 時各處理組除京尼平苷和京尼平苷酸含量顯著低于處理22 d外，其他次級代謝產物含量均顯著高于處理22 d。

圖2 濾除自然光中UV-B 輻射成分對杜仲葉片光合參數的影響Fig.2 The effect of filtering out UV-B radiation components in natural light on photosynthetic parameters of E.ulmoides leaves

表1 濾除自然光中UV-B 輻射成分后杜仲葉片水分利用效率、葉片羧化效率和氣孔限制值?Table 1 The leaf water use efficiency, leaf carboxylation efficiency and stomatal limitation value of E.ulmoides after UV-B radiation was filtered out from natural light

圖3 濾除自然光中UV-B 輻射成分對杜仲葉片光合色素的影響Fig.3 The effect of filtering out UV-B radiation components in natural light on photosynthetic pigments of E.ulmoides leaves

3 結論與討論

綜上所述，長期濾除太陽輻射光譜中UV-B成分后，杜仲葉片光合速率和穩態光化學效率增加，光合色素含量提高，處理41 d 時次級代謝產物除京尼平苷酸含量顯著低于處理22 d 外，綠原酸、京尼平、京尼平苷和桃葉珊瑚苷含量均顯著高于處理22 d。結果表明，在長期濾除自然光譜中UV-B 成分處理中，杜仲能正常從根系吸收水分，提高蒸騰，保證植株正常發育。另外，長期濾除UV-B 成分后，杜仲葉表皮層中積累較多的次級代謝產物，以充分抵御環境中UV-B 輻射波動引起的傷害。可見，杜仲更大程度上通過葉片結構和光合作用的變化來適應UV-B 輻射，自然環境中UV-B 成分依然是限制藥用植物杜仲葉片光化學效率的因素之一。

由于植物在環境中無法移動位置，在其生長周期中不可避免地會受到太陽紫外輻射這個自然環境因子的影響。UV-B 輻射對植物生長發育、光合生理過程及次級代謝的影響一直是國內外學者關注的重點[16]。植物光合作用和次級代謝產物的改變影響地球生物圈中動物、微生物及人類的生長發育，決定著生態系統對UV-B 輻射的響應程度。采用濾光薄膜濾除自然環境中大部分UV-B 輻射成分的方法，是研究UV-B 的植物生物學效應的重要途徑之一。

光合作用是一個極為復雜的生理過程，包括一系列光化學步驟和物質轉變過程，其對UV-B 輻射的敏感度在不同作物間各有差異。根據前人研究結果，UV-B 輻射增強導致光合作用受阻（主要包括葉片氣孔或非氣孔因素）[17]、葉綠體結構被破壞并使葉綠素分解[18]、希爾反應活性和RUBP再生率下降[19]等。王丹等[20]發現UV-B 輻射下紫花苜蓿幼苗Pn、Gs和Tr顯著降低，認為UV-B 輻射使葉綠體結構中光敏色素B 被破壞，從而導致光合速率下降。本研究結果表明，與對照組相比，濾除UV-B 輻射22 d 時杜仲葉片Pn、Tr和Gs顯著下降，而濾除41 d 時葉片Pn、Tr和Gs顯著增加，Ci在T1 處理組顯著降低，說明自然環境中UV-B輻射對杜仲葉片的Pn具有一定的限制作用。經過短期濾除（22 d），杜仲葉片可能產生了脅迫記憶，隨著濾除時間的延長，與短期濾除相比其耐受能力更強。擬南芥和玉米植株經過多次脫水、復水處理后，會表現出比第1 次處理更高的水分利用率[21]。在本試驗中，對照組杜仲葉片Ci升高且Gs值降低，因此影響Pn的主要原因是非氣孔限制因素。此外，EWU的降低表明杜仲在濾除UV-B輻射后積累有機物所需水分減少，足以保證植株正常生長發育。EC是表征植物光合能力的重要參數，對光合速率起著決定作用[22]，本研究中發現，長期濾除UV-B 后杜仲葉片EC顯著增加，說明UV-B 輻射是影響杜仲葉片Pn的原因。據此推測，長期濾除環境中UV-B 輻射對杜仲葉片光合速率有正效應。

圖4 濾除自然光中UV-B 輻射成分對杜仲葉片次級代謝產物含量的影響Fig.4 The effect of filtering out UV-B radiation components in natural light on secondary metabolite contents of E.ulmoides leaves

葉綠素熒光是光合作用與外界環境間的探針，利用該指標可以探究植物光合系統對環境UV-B 變化的響應機制[23]。PS Ⅱ是UV-B 對光合作用損傷的主要靶子，Fv/Fm被用于估測植物葉片PS Ⅱ反應中心的最大光能轉化效率，ΦⅡ代表PS Ⅱ反應中心電荷分離的實際化光化學效率[24]。本研究中發現，濾除UV-B 輻射后杜仲葉片Fv/Fm與對照無顯著差異，RET在各處理組均顯著高于對照，ΦⅡ在濾除41 d 時顯著增加。這與前人的研究結果一致，丁偉等[4]經研究發現高山植物美麗風毛菊在濾除UV-B 輻射后Fv/Fm和ΦⅡ均顯著增加，認為自然環境中的UV-B 成分抑制了Fv/Fm的恢復，限制了PS Ⅱ中原初電子受體QA的氧化速率，也制約著PS Ⅱ反應中心的電子傳遞和光化學量子效率的恢復。因此，導致杜仲光合速率降低的原因是UV-B 影響了PS Ⅱ系統光化學能的轉換，破壞了電子傳遞體，從而降低了光能轉換效率，自然環境中UV-B 成分是限制藥用植物杜仲葉片光化學效率的重要因素。

光合色素參與光合作用中光能的吸收、傳遞和轉化，其含量在一定程度上反映植物利用光能和制造有機物的能力，制約著植物生長發育，是植物干物質積累和產量的基礎[25]。通常認為，UV-B 輻射會使植物葉綠體超微結構遭到破壞，表現為葉綠體結構變形、膜系統損傷、類囊體片層和基粒排列稀疏紊亂[26]，葉綠素水平對UV-B 的響應依賴于植物的發育過程和環境條件，強UV-B輻射下光合色素含量的降低可能緣于其對光合色素合成過程的限制或其光抑制及光損傷作用[27]。本研究結果也表明，濾除UV-B 輻射成分后，杜仲葉片的葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量均表現為增加的趨勢，能免于強UV-B 輻射的損傷；對照組中UV-B 輻射成分降低了葉片葉綠素的含量，表明UV-B 輻射破壞了杜仲葉綠體結構，抑制光合蛋白復合物和細胞器的形成，導致葉綠素含量下降。類胡蘿卜素分子能與生物膜結合，吸收紫外光，是一種重要的抗氧化劑，在電子的吸收和傳遞過程中起重要作用，保護細胞、葉綠體和葉綠素免受傷害[28]。本研究結果表明，濾除UV-B 輻射后杜仲葉片類胡蘿卜素含量呈降低趨勢。說明隨UV-B 濾除率的增加，植物葉片受到紫外輻射的強度減弱，因此葉綠素含量增加，類胡蘿卜素含量減少，也驗證了自然環境中UV-B 輻射成分對葉片光合色素合成過程的抑制和膜脂過氧化作用是光合速率降低的本質原因[29]。

植物對UV-B 輻射的一個重要防御策略是通過在葉片表皮層中形成、控制和誘導脅迫反應相關植物化學物質來提高自身的抗逆性。與抗性相關的植物化學物質中次級代謝產物是一大類普遍存在的植物特異性化合物，對植物生長、發育和緩解脅迫至關重要。這些次級代謝產物對中波紫外線具有強烈的吸收作用，允許可見光通過，不影響光合作用進行，能形成一道天然屏障，是植物的紫外線保護劑[30]。李錦馨等[31]經研究發現，植物次級代謝產物的合成與環境UV-B 輻射強度呈正相關，即葉片照射的UV-B 強度越高，植株生成的次級代謝產物越多。付金穎[32]的研究結果表明，短期增強UV-B 輻射能夠增加杜仲葉片綠原酸含量，降低桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷含量。馬春暉[33]經研究發現，增強UV-B 輻射后祁菊花序中綠原酸和黃酮類物質含量顯著提高。本研究結果表明，長時間濾除環境UV-B 成分后，杜仲葉片中僅京尼平苷酸含量降低，綠原酸、京尼平、京尼平苷和桃葉珊瑚苷含量呈增加趨勢，表明長期生活在自然環境下不利于杜仲葉表皮層中次級代謝產物的積累，濾除UV-B 成分后次級代謝產物的增加足以抵御環境UV-B 輻射波動的影響。如楊超[34]經研究發現，UV-B 脅迫影響了南方紅豆杉體內紫杉醇的含量，而紫杉醇可以顯著降低植株內過氧化氫和超氧陰離子等自由基的含量，證實了紫杉醇等生物堿的合成有利于植物對環境UV-B輻射的適應。因此，長期的UV-B 濾除對杜仲產生了馴化作用，馴化是提高藥用植物藥效成分含量的關鍵步驟，有些藥用植物在輕度脅迫下反而能產生更多的次級代謝化合物，以提高其適應性。

本研究中僅對溫室盆栽杜仲實生苗進行試驗處理，而溫度、水分和光照時間等不可控因素均會影響杜仲葉片中主要藥用活性物質的含量。為了提高杜仲葉產量和品質，下一步將研究在大田推廣中采用濾除自然光譜中UV-B 輻射成分等措施對杜仲的生長特征、光合作用及生理代謝特征的影響。