黃野螟化學感受基因的鑒定與分析

李資聰 劉磊 楊斌 嚴善春 王桂榮

摘要 ：昆蟲的化學感受系統在昆蟲的取食、交配等多種行為中發揮著重要作用。黃野螟Heortia vitessoides是一種寡食性害蟲，幼蟲具有聚集性、暴食性等特點，對土沉香Aquilaria sinensis危害嚴重。本研究使用高通量測序技術對黃野螟成蟲觸角和口器的轉錄組進行了測序，共鑒定到124個化學感受基因，包括50個氣味受體（odorant receptor，OR）基因，19個離子型受體（ionotropic receptor，IR）基因，17個味覺受體（gustatory receptor，GR）基因，19個氣味結合蛋白（odorant binding protein，OBP）基因，17個化學感受蛋白（chemosensory protein，CSP）基因和2個感覺神經元膜蛋白（sensory neuron membrane protein，SNMP）基因。通過系統進化和差異表達分析，對黃野螟化學感受基因的分化，以及不同性別、不同組織間的表達差異進行系統性的研究。以氣味受體為例，HvitOR42、HvitOR43和HvitOR48聚在傳統的性信息素受體（pheromone receptor，PR）分支，其中HvitOR42和HvitOR43在雄性成蟲觸角中特異性高表達，這3個氣味受體可能參與識別黃野螟雌性成蟲釋放的性信息素。此外，HvitOR20在雌性成蟲觸角中特異性高表達，可能與雌性成蟲交配和產卵等行為相關。本研究為進一步探究黃野螟的化學感受機制提供了分子基礎，為開發以化學生態學為基礎的黃野螟綠色害蟲防控技術提供了理論依據。

關鍵詞 ：黃野螟; 轉錄組; 高通量測序; 化學感受基因

中圖分類號：

S 433.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021151

Identification and analysis of chemosensory genes in Heortia vitessoides

LI Zicong1， LIU Lei1， YANG Bin2*， YAN Shanchun1*， WANG Guirong2

（1.College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China; 2.State Key

Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Insect chemosensory system plays an important role in various behaviors such as feeding and mating.The yellow stem borer Heortia vitessoides is a kind of oligophagous pests against Aquilaria sinensis， causing serious damages by larval aggregation and overeating.In this study， high-throughput sequencing technology was used to obtain the transcriptomes in the antennae and mouthparts of H.vitessoides adults.As a result， 124 chemosensory genes were identified， including 50 odorant receptor （OR） genes， 19 ionotropic receptor （IR） genes， 17 gustatory receptor （GR） genes， 19 odorant binding protein （OBP） genes， 17 chemosensory protein （CSP） genes and two sensory neuron membrane protein （SNMP） genes.Phylogenetic and differential expression analyses were carried out to systematically study the gene differentiation and tissue specific expression of these chemosensory genes in H.vitessoides.Taking the odorant receptors as an example， HvitOR42， HvitOR43 and HvitOR48 clustered in the clade of traditional sex pheromone receptor， among which HvitOR42 and HvitOR43 were highly expressed in the male adult antennae， which were considered important in the recognition of sex pheromones produced by the females.In addition， HvitOR20 was highly expressed in the female antennae， which was considered to be involved in the female specific behaviors such as mating and oviposition.This study provided a molecular basis for further study of the chemosensory mechanism in H.vitessoides， and helps develop new methods for controlling H.vitessoides.

Key words

Heortia vitessoides; transcriptome; high-throughput sequencing; chemosensory genes

昆蟲包括嗅覺和味覺在內的化學感受系統能識別環境中的各種化學物質，影響昆蟲的取食、求偶、交配和躲避天敵等多種行為[12]。昆蟲的外周化學感受神經元是識別外部環境化學物質的主要神經通路，包含嗅覺感受神經元（olfactory receptor neuron，ORNs）和味覺感受神經元（gustatory receptor neuron，GRN）[3]。嗅覺感受神經元主要分布于昆蟲的觸角，而味覺感受神經元主要分布于喙。除此之外，化學感受神經元也在下唇須、下顎須、足和翅等多個組織中分布[4]。在分子層面上，化學感受的過程主要由幾個功能上相互關聯的不同基因家族所介導，包括氣味受體（odorant receptor，OR）、離子型受體（ionotropic receptors，IR）、味覺受體（gustatory receptor，GR）等3個受體蛋白家族和氣味結合蛋白（odorant binding protein，OBP）、化學感受蛋白（chemosensory protein，CSP）、感覺神經元膜蛋白（sensory neuron membrane protein，SNMP）[510]等3個非受體蛋白家族。這些基因家族在昆蟲化學感受過程中起到了至關重要的作用，可作為未來害蟲防治的潛在靶標。

黃野螟Heortia vitessoides屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae，是典型的寡食性食葉害蟲，主要分布于我國熱帶和南亞熱帶氣候區，其高度適生區集中在珠江流域和瀾滄江流域南部，未來適生區有向北擴展的趨勢[11]。該蟲僅取食沉香屬Aquilaria和漆樹屬Toxicodendron等的少數幾種植物，是我國土沉香Aquilaria sinensis的主要害蟲[12]。土沉香是瑞香科Thymelaeceae沉香屬Aquilaria常綠喬木，為我國沉香的主要植物來源[13]。沉香是生產中藥、熏香和香水的重要原料，其在國際市場上價格堪比黃金。野生土沉香已被中華人民共和國農業農村部和國家林業和草原局列為國家瀕危三級保護植物、國家二級重點野生保護植物[14]。因具有較高的經濟價值，土沉香人工種植面積不斷擴大，病蟲害問題日益凸顯。黃野螟是我國土沉香種植區的重點防治對象，具有聚集性、暴食性等特點，幼蟲數日內可將植株葉片取食一空，嚴重時可導致種植區內90%以上植株大面積受損，嚴重影響土沉香的生長[15]。目前，針對黃野螟的防治方法主要是化學防治[16]，但化學防治專一性差，對非靶標生物尤其是天敵資源危害較大。此外，化學農藥的不合理使用會影響沉香的藥用及食用價值，導致一系列的食品安全問題。利用昆蟲性信息素防治害蟲，具有專一性強、對環境無污染等優點，是綠色無公害的新型害蟲防控方法。然而，針對黃野螟性信息素及其識別機制的研究較少，識別性信息素的化學感受基因也未知，亟需深入研究。

本研究使用Illumina HiSeqTM 2000高通量測序平臺對黃野螟雌、雄成蟲的觸角和口器進行了轉錄組測序，鑒定了黃野螟OR、IR、GR、OBP、CSP和SNMP 6個基因家族的化學感受基因，并通過系統進化和差異表達基因（differential expression gene，DEG）分析，對黃野螟化學感受基因的分化，以及不同性別、不同組織間的表達差異情況進行系統性研究。本研究旨在為開發黃野螟的新型防治策略奠定理論基礎，為從分子層面上以受體基因為靶標篩選和設計新型高效的引誘劑和交配干擾劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

黃野螟幼蟲采自廣東省廣州市天河區火爐山森林公園（113°38′E，23°19′N），帶回實驗室后在溫度（26±1）℃、濕度（65±5）%、光周期L∥D=15 h∥9 h的人工氣候箱中使用新鮮的土沉香葉片飼養。幼蟲化蛹后，根據第8和第9腹節的形態差異，將雌、雄蟲分別置于不同養蟲籠，成蟲羽化后飼喂10%蜂蜜水。選取3日齡未交配的雌、雄成蟲各120頭進行觸角和口器（喙、下顎須和下唇須）等組織的收集，取下的組織置于-80℃保存備用。

1.2 總RNA提取和文庫構建與測序

采用TRIzol法分別提取黃野螟雌、雄成蟲觸角和口器的RNA。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。使用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific，USA）檢測RNA的濃度和純度，使用Agilent 2100 （Agilent Technologies，USA）檢測RNA的完整性。取檢測合格的RNA樣品各1.5 μg，按照NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，USA）的操作方法進行文庫構建，并使用Agilent Bioanalyzer 2100系統對文庫質量進行檢查，檢查合格后使用Illumina HiSeqTM 2000測序平臺進行測序。

1.3 轉錄組測序數據的組裝與注釋

測序得到的原始數據通過刪除接頭序列、含有較高比率未知堿基的序列、長度過短的序列，最終得到clean reads。使用Trinity軟件對clean reads進行組裝。將組裝獲得的unigene分別與非冗余蛋白數據庫（non-redundant protein sequence database，NR）、蛋白家族（protein family，PFAM）、SwissProt蛋白序列數據庫（a manually annotated， non-redundant protein sequence database）、基因本體論（gene ontology database，GO）、直系同源基因簇（clusters of orthologous groups of proteins，KOG/COG）、直系同源蛋白分組比對（evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups，EggNOG）和京都基因與基因組百科（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等7個數據庫進行比對，獲得相應的注釋信息。

1.4 黃野螟化學感受相關基因的鑒定及基因表達量分析

黃野螟化學感受基因的鑒定有兩種方法。第一，從NR、PFAM、SwissProt、GO、COG、KOG、EggNOG、KEGG數據庫注釋的結果中提取比對到的黃野螟化學感受基因序列。第二，從SilkDB 3.0（https：∥silkdb.bioinfotoolkits.net/）數據庫中下載家蠶Bombyx mori的化學感受基因，使用本地BLAST（BLASTx、BLASTn、tBLASTn）查找這些基因在黃野螟中的同源序列（E value<1×10-2）。將上述得到的序列合并，使用NCBI在線數據庫再次驗證，刪除錯誤匹配或匹配度較低的序列，最終獲得每個基因家族的候選基因。使用ExPASy（expert protein analysis system）服務器（http：∥web.expasy.org/translate/）預測所有候選基因的ORF，并分別與其他物種的同源基因比對確認序列是否為全長。使用TMHMM 2.0預測候選基因的跨膜結構域（transmembrane domain，TMD）。計算所有候選基因的FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）值，比較候選基因在黃野螟成蟲不同組織中的表達情況[17]。

1.5 系統進化分析

從GenBank數據庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中下載不同物種的化學感受基因用來構建系統進化樹，包括家蠶、棉鈴蟲Helicoverpa armigera、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、桃蛀螟Conogethes punctiferalis、煙青蟲Helicoverpa assulta和黑腹果蠅Drosophila melanogaster。通過MAFFT（https：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）進行氨基酸序列比對。使用RAxML 8.0通過最大似然法進行系統進化樹的構建。系統進化樹使用Jones-Taylor-Thornton氨基酸替代模型（JTT），快速hill-climbing算法（-fd），進行1 000次bootstrap統計學檢測，對最佳的樹拓撲結構在似然值對數上設置模型最佳的精確度（-e），使用默認值0.01。最終選取最優結果并使用Fig Tree v 1.4.0軟件進行進化樹的編輯。

2 結果與分析

2.1 黃野螟觸角、口器轉錄組的組裝和注釋

利用Illumina HiSeqTM 2000平臺對黃野螟雌、雄成蟲觸角和口器共4個樣品進行轉錄組測序，最終得到29.03 Gb，包含97 063 932條clean reads的轉錄組數據。各個樣品總堿基數均達到6.37 Gb以上，測序質量分值為Q20和Q30時，質量合格的reads比例分別高于97.15%和92.38%，GC含量在45.08%～46.20%（表1）。將4個樣品的測序結果合并進行組裝，共獲得109 943條轉錄本和43 058條unigenes，N50長度分別為3 372 bp和2 086 bp，平均長度分別為1 936.34 bp和1 168.64 bp，具體結果見表2。使用不同的數據庫對unigene進行了注釋，獲得了4 360～15 044條注釋結果，其中NR數據庫注釋到的unigene數量最多，占總基因數量的34.94%（表3）。

2.2 氣味受體家族基因的鑒定及分析

通過轉錄組測序總共鑒定到50個OR基因，命名為HvitOR1～HvitOR50，GenBank登錄號為MW717297～MW717346（表4）。其中，獲得全長序列的OR基因有31個，氨基酸序列長度為370～474 aa，跨膜結構域（transmembrane domain， TMD）的數量為4～7個。系統進化分析表明（圖1），黃野螟的氣味受體在進化樹各個分支中均有分布。其中，HvitOR2為氣味受體共受體（olfactory receptor co-receptor，ORco），HvitOR42、HvitOR43、HvitOR48為性信息素受體（pheromone receptor，PR）。DEG結果表明，性信息素受體HvitOR42和HvitOR43在雄性觸角中均為高表達（表達量大于雌性10倍以上），但HvitOR48在雌、雄觸角中的表達量差異不大。此外，HvitOR20在雌性觸角中高表達（表達量大于雄性10倍以上）。HvitOR2、HvitOR8、HvitoR14、HvitOR15、HvitOR18、HvitOR19、HvitOR22、HvitOR26、HvitOR28、HvitOR30、HvitOR32、HvitOR33、HvitOR40、HvitOR41、HvitOR45和HvitOR46在雄性口器中高表達（表達量大于雌性10倍以上）（表4）。

2.3 離子型受體家族基因的鑒定及分析

本研究共鑒定到19個IR基因，GenBank 登錄號為MW717347～MW717364，其中HvitIR25a由于序列長度過短未上傳（表5）。有7個IR基因獲得了全長序列，氨基酸序列長度在548 aa（HvitIR76b）到912 aa（HvitIR8a）之間，TMD結構數量為3～4個。系統進化分析結果表明，黃野螟的19個IR分別聚在4個IR分支上（圖2）。DEG結果表明，觸角中HvitIR8a和HvitIR25a的表達量高于其他IR。此外，HvitIR2、HvitIR8a、HvitIR21a、HvitIR75p1、HvitIR87a和HvitIR93a均在雄性口器中高表達（表達量大于雌性10倍以上）（表5）。值得注意的是，黃野螟的HvitIR41a出現了特異性序列分化，且HvitIR41a.2的表達量高于HvitIR41a.1。

2.4 味覺受體家族基因的鑒定及分析

通過對黃野螟觸角與口器的轉錄組進行分析，鑒定到了17個GR，將其命名為HvitGR1～HvitGR17，GenBank登錄號為MW717365～MW717381（表6）。然而，只有1個GR（HvitGR3）獲得了全長，氨基酸長度為476 aa。系統進化分析表明（圖3），HvitGR1、HvitGR2、HvitGR3與家蠶、棉鈴蟲和煙青蟲的二氧化碳受體聚為一支。HvitGR4～HvitGR8聚在糖受體分支，HvitGR9～HvitGR12聚在果糖受體分支， HvitGR13～HvitGR16聚在苦味受體分支。DEG結果表明，GR的表達量普遍較低，其中果糖受體HvitGR10在觸角中表達含量最高，而二氧化碳受體HvitGR1～HvitGR3在口器中的表達量較高（表6）。

2.5 氣味結合蛋白家族基因的鑒定及系統進化分析

本研究共鑒定到19個OBP，包括2個普通氣味結合蛋白（general odorant binding protein，GOBP）和2個性信息素結合蛋白（pheromone binding protein，PBP），分別命名為HvitGOBP1、HvitGOBP2、HvitPBP1和HvitPBP2，其他序列命名為HvitOBP1～HvitOBP4和HvitOBP6～HvitOBP16（未鑒定到HvitOBP5），GenBank 登錄號為MW717382～MW717400（表7）。其中，有14個OBP基因獲得了全長，氨基酸序列長度在138～337 aa之間。根據氨基酸序列結構和進化分析（圖4），HvitGOBP1、HvitGOBP2、HvitPBP1、HvitPBP2、HvitOBP2、HvitOBP9～HvitOBP11、HvitOBP13～HvitOBP15屬于Classic亞家族;HvitOBP4、HvitOBP6和HvitOBP12屬于Minus-C亞家族;HvitOBP1、HvitOBP3、HvitOBP7、HvitOBP8和HvitOBP16屬于Plus-C亞家族。DEG結果表明，HvitGOBP2、HvitPBP1、HvitPBP2、HvitOBP2、HvitOBP10、HvitOBP11、HvitOBP13和HvitOBP15均在雄蟲口器中高表達，并且表達量為雌蟲口器的10倍以上（表7）。

2.6 化學感受蛋白家族基因的鑒定及系統進化分析

本研究共鑒定到17個CSP，命名為HvitCSP1～HvitCSP4和HvitCSP7～HvitCSP19（未鑒定到HvitCSP5和HvitCSP6），GenBank 登錄號為MW717401～MW717416，其中HvitCSP9由于序列長度過短，未上傳（表8）。共有10個CSP為全長基因序列，且均具有4個保守的半胱氨酸結構，氨基酸序列長度在109～154 aa。系統進化分析表明（圖5），所有候選CSP基因都與至少一個鱗翅目同源基因聚在一支上。DEG結果表明，HvitCSP2在雌雄觸角和口器中表達量最高，HvitCSP17和HvitCSP19在雌性觸角中偏好表達（表達量大于雄性3倍以上）。此外，HvitCSP8、HvitCSP15和HvitCSP17在雄性口器偏好表達（表達量大于雌性3倍以上）（表8）。

2.7 感覺神經元膜蛋白家族基因的鑒定及系統進化分析

通過對黃野螟觸角與口器轉錄組的分析，共鑒定到2個具有全長基因序列的SNMP，命名為HvitSNMP1和HvitSNMP2，氨基酸長度分別為527 aa和524 aa，GenBank 登錄號為MW717417和MW717418（表9）。系統進化分析表明（圖6），HvitSNMP1和HvitSNMP2與其他鱗翅目物種的SNMP基因處在不同的分支。DEG結果表明，HvitSNMP1在雄性口器中高表達（表達量大于雌性10倍以上）（表9）。

3 討論

以性誘劑為主的新型害蟲綠色防控技術具有安全、高效和環保等優點，其在林業害蟲的防控中發揮了重要作用。研究害蟲的化學感受基因，有利于深入了解害蟲的嗅覺系統，進而開發更高效的害蟲嗅覺行為調控劑。高通量測序技術的發展，極大地促進了害蟲化學生態學研究[19]。本研究采用Illumina HiSeqTM 2000高通量測序平臺對黃野螟成蟲觸角與口器中表達的化學感受基因進行了全面的鑒定與分析，共鑒定到124個化學感受基因，包括50個OR、19個IR、17個GR、19個OBP、17個CSP和2個SNMP。相對于之前的研究[18]，本研究新鑒定到22個OR、7個IR、13個GR、11個OBP和9個CSP，未鑒定到HvitOBP5、HvitCSP5和HvitCSP6，但是鑒定到的基因數量和質量均優于之前的研究。本研究為進一步研究黃野螟的化學感受機制提供了分子基礎，為開發以化學生態學為基礎的黃野螟綠色害蟲防控技術提供了理論依據。

昆蟲OR是一種跨膜受體蛋白，具有7個跨膜結構域。傳統氣味受體（conventional odorant receptor，OrX）是一個高度分化的受體家族，需要與高度保守的氣味受體共受體結合形成異源多聚體，共同完成識別氣味分子的功能[5]。本研究在黃野螟中鑒定到50個OR，數量與其他鱗翅目近緣昆蟲接近[20]。然而，在黃野螟的50個OR中僅鑒定到3個性信息素受體（PR），數量低于其他鱗翅目近緣物種，例如，亞洲玉米螟和桃蛀螟中均鑒定到8個PR，小菜蛾Plutella xylostella中鑒定到9個PR[2123]。在黃野螟的3個PR中，僅HvitOR42和HvitOR43在雄性觸角中高表達，可能與識別雌性性信息素相關。此外，在海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis的研究中發現，SlitOR5可以特異性識別性信息素組分（Z，E）-9，11-14∶OAc，該受體所在的分支為“新PR”分支[24]。在本研究中，雖然HvitOR8、HvitOR30、HvitOR31、HvitOR32、HvitOR38、HvitOR44聚在“新PR”分支上，但是它們并未在雄蟲觸角中高表達。值得注意的是，HvitOR20在雌性觸角中高表達，說明其可能在雌蟲產卵相關行為中發揮作用。

IR由離子型谷氨酸受體超家族（iGluRs）進化而來，主要在觸角中表達，用于識別酸、胺以及溫、濕度等[25]。在本研究中，我們共鑒定到19個IR，進化分析結果表明，黃野螟IR聚在4個不同分支，可能具有不同的潛在功能。在第一分支中，HvitIR8a和HvitIR25a在不同物種間相對保守，有研究表明這兩種IR發揮了共受體的功能[26]。在第二分支中，HvitIR76b與HvitIR93a聚為同一分支，其中IR76b被認為可能是第二類共受體[2627]。第三分支中的IR主要與昆蟲非化學感受相關，如果蠅的IR40a和IR68a參與了昆蟲的濕度感受[28]。第四分支中的IR主要參與酸類化合物識別，果蠅的IR64a和IR75a與IR8a共表達可分別被乙酸和苯乙酸激活[26， 28]。值得注意的是，在第二分支中，HvitIR41a與其他物種相比發生了特異性序列分化，可能與黃野螟的特異性行為相關，但具體功能還有待進一步研究。在果蠅IR的研究中，IR41a與IR76b共表達用于識別多胺類物質，這類物質對果蠅有吸引作用[29]。

根據系統進化關系和功能研究，GR可分為4個分支：二氧化碳受體分支、糖受體分支、果糖受體分支和苦味受體分支[3032]。在果蠅和家蠶基因組中分別鑒定到56個和65個GR[3233]。在黃野螟中，我們僅鑒定出17個GR，與桃蛀螟[22]和草地螟Loxostege sticticalis[34]的GR數量相似，但數量少于果蠅和家蠶，表明GR可能存在于除成蟲觸角和口器之外的其他組織中。進化分析結果顯示，HvitGR1～HvitGR3為CO2受體，HvitGR4～HvitGR8為糖受體，HvitGR9～HvitGR12為果糖受體，HvitGR13-HvitGR17為苦味受體。目前關于GR功能研究多集中在CO2受體、糖受體和果糖受體，而關于苦味受體的功能研究報道相對較少。在家蠶中，BmorGR66基因突變可導致家蠶喪失對桑葉的專食性[35]。在小菜蛾中，PxylGR34基因的表達介導了小菜蛾對油菜素內酯的厭惡行為反應[36]。這些研究對了解黃野螟寡食性的分子機制具有指導意義。

OBP和CSP是一類具有典型分子特征的水溶性小分子蛋白，在多個組織中均有表達且表達量較高，主要參與氣味分子的運輸。典型的OBP和CSP序列分別具有6個和4個保守的半胱氨酸，通過相互交叉形成二硫鍵影響OBP和CSP的三維結構。OBP和CSP的特異性表達一定程度上暗示了它們在昆蟲生命活動中的作用。除了在觸角和口器中表達以外，OBP和CSP也在生殖器和足等多種組織中表達[37]。此外，OBP和CSP也具有性別特異性高表達，這可能與雌蟲或雄蟲的特異性生理和行為有關。在本文中，HvitGOBP2、HvitPBP1和HvitPBP2等8個OBP在口器中均為雄性高表達（表達量大于雌性10倍以上），HvitCSP8、HvitCSP15和HvitCSP17在雄性口器中偏好表達（表達量大于雌性3倍以上），可能與性信息素的識別相關。

SNMP是一種膜蛋白，且數量較少，在大多數鱗翅目昆蟲都只有2個。SNMP1主要分布在觸角中，與性信息素特異性神經元有關，并參與昆蟲對性信息素的識別過程[38]。SNMP2在昆蟲中的功能尚不明確，具體功能有待進一步的研究。此外，最近通過基因組及轉錄組數據分析，在鱗翅目昆蟲中鑒定出SNMP3基因，它在幼蟲中腸特異性表達，具體功能尚未明確[39]。

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（責任編輯：楊明麗）