實時直接分析質譜法快速檢測保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑

齊春艷 黎欣欣 張靜 雷毅

摘要：目的：建立一種實時直接分析離子源（Direct analysis in real time，DART）結合四極桿/靜電軌道離子阱高分辨質譜法（quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，Q-Orbitrap HRMS）快速篩查保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑。方法：樣品經80%乙腈水超聲提取，過0.22 μm微孔濾膜后用DART-Q-Orbitrap HRMS聯用儀測定。DART離子源的電離模式為正模式，樣品傳輸速率為0.20 mm/s，離子化溫度為400 ℃，柵極電壓為400 V。Q-Orbitrap HRMS掃描模式為全掃描/數據依賴性二級掃描（Full MS/ddMS2）。結果：在全掃描模式下測定目標化合物的一級精密質量數，與理論精密質量數相比，相對質量偏差小于1.89 ppm，可實現精準定性;同時采集二級質譜信息，進一步提高定性準確性。該方法檢出限范圍為0.03～2.50 mg/kg，滿足篩查要求。結論：該方法具有分析速度快，定性準確，環境友好等優勢，可作為保健酒中非法添加的12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準定性檢測方法。

關鍵詞：質譜法;保健酒;PED5抑制劑;非法添加

Rapid Detection of 12 Illegally Added PDE5 Inhibitors in Health Wine by Real-Time Direct Analysis Mass Spectrometry

QI Chunyan， LI Xinxin， ZHANG Jing， LEI Yi

（Guangdong Food Inspection Institute（Guangdong alcohol testing center）， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective：To establish a real-time direct analysis in real time（DART）combined with quadrupole/Orbitrap high resolution mass spectrometry（q-orbitrap HRMS）to quickly screen 12 kinds of PDE5 inhibitors in health wine.Methods： the samples were extracted by ultrasonic with 80%acetonitrile water and passed 0.22μM microporous membrane was filtered and determined by dart-q-orbitrap HRMS.The ionization mode of dart ion source is positive mode，the sample transfer rate is 0.20 mm/s，the ionization temperature is 400 ℃，and the gate voltage is 400 V.Q-orbitrap HRMS scanning mode is full scanning/data dependent secondary scanning（full MS/ddms2）.Results： the first-order precision mass number of the target compound was determined in the full scanning mode.Compared with the theoretical precision mass number，the relative mass deviation was less than 1.89 ppm，accurate and qualitative;At the same time，the secondary mass spectrometry information is collected to further improve the qualitative accuracy.The detection limit of this method is 0.03～2.50 mg/kg，which meets the screening requirements.Conclusion： this method has the advantages of fast analysis speed，accurate qualitative and environment-friendly.It can be used as a rapid screening and accurate qualitative detection method for 12 kinds of PDE5 inhibitors illegally added in health wine.

Keywords： mass spectrometry; health wine; PED5 inhibitor; illegally added

保健酒是以白酒或其他酒類為酒基，選擇有治療作用和滋補性能的中藥或藥食同源物質如人參、鹿茸、海馬、海參等，通過浸泡、浸漬、蒸餾等加工手段制成的飲料酒，具有滋補健體、緩解疲勞、行氣活血等保健作用[1-2]。面對巨大的市場需求和利益誘惑，一些不法商家為凸顯產品功能，吸引消費者，在其產品中非法加入西地那非、伐地那非、育亨賓等PDE5抑制劑（5型磷酸二酯酶抑制劑），達到獲取暴利的目的[3]。由于非法添加存在隨意性大，劑量不明確等問題，消費者若長期、超量食用可能會引起心律失常、心肌梗塞、高血壓等不良反應，甚至威脅生命安全[4]。

目前，PDE5抑制劑的檢測方法主要有膠體金免疫層析法（GICA）、薄層色譜法（TLC）、拉曼光譜法、近紅外光譜法（NIRS）、液相色譜法（LC）和液相色譜串聯質譜法等（LC-MS/MS）。其中，GICA法、TLC法、拉曼光譜法、NIRS法往往存在靈敏度低、選擇性差、假陽性等問題[5]。LC法和LC-MS/MS法因其高靈敏度和高選擇性，是目前常用的檢測方法。這些方法傳統檢測方法雖然前處理比較簡單，但是往往存在分離分析時間長，有機試劑消耗量大，環境污染大等缺點。

DART-Q-Orbitrap HRMS法是結合了敞開式常壓電離源和高分辨質譜儀兩者優勢的一種檢測技術。采用DART離子源進行檢測時，待測樣品無需冗長的色譜分離過程，分析速度快，可實現實時定性分析。Q-Orbitrap HRMS結合了四級桿的高選擇性和離子阱的高靈敏度、高分辨率的優勢，可實現目標物的準確定性。

本研究采用DART-Q-Orbitrap HRMS技術，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準定性的檢測方法。該方法具有分析速度快，有機試劑用量少、綠色環保等優勢。此外，通過一級全掃描獲得12種PDE5抑制劑的精確質量數，根據各目標物的提取離子圖進行初步定性，同時結合數據依賴性二級掃描模式獲得12種PDE5抑制劑的二級特征質譜圖，實現目標化合物的精準定性。本方法能夠快速、準確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準定性，為維護保健酒行業的健康發展和保障我國食品安全提供技術

支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西地那非、紅地那非、偽伐地那非、氨基他達拉非、育亨賓（純度均≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院）;羥基豪莫西地那非、那紅地那非、硫代西地那非（純度均≥99.3%，加拿大TLC標準品公司）;硫代艾地那非、伐地那非（純度均≥98.6%，美國Stanford Chemicals有限公司）;他達拉非（純度為99.2%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）;去甲基他達拉非（純度為99.3%，北京壇墨質檢科技股份有限公司）;乙腈（色譜純，德國Merck公司）;試驗用水為一級水（自制）;GHP針式過濾器（0.22 μm，美國波爾有限公司）。

1.2 儀器與設備

DART實時直接分析離子源（美國Ion Sense公司）;Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher公司）;電子分析天平（MS105DU、PL602E，瑞士Mettler Toledo公司）;移液器（1～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，1.0～10 mL，德國Eppendorf公司）;EOAA-HM-01多管渦旋混合器（上海安譜實驗科技股份有限公司）;KQ-500DE數控超聲波清洗器（東莞科橋超聲波設備有限公司）;Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別稱取各標準品10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并定容至刻度，得濃度為1.00 mg/mL的標準物質儲備液。貯存于2～8 ℃冰箱中。

分別準確移取10 μL各標準物質儲備液于10 mL容量瓶中，用80%乙腈水稀釋并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/L的混合標準工作溶液。

1.3.2 儀器條件

DART離子源條件設置：電離方式為正離子模式;離子化氣體為氦氣，壓力為0.55 MPa;待機氣體為氮氣，壓力為0.30 MPa;進樣模式為12-Dip-it模式;離子源出口至質譜進口距離為2.40 cm;樣品傳輸速率為0.20 mm/s;離子化溫度為400 ℃;柵極電壓為400 V。

Exactive條件設置：電離方式為正離子模式;離子傳輸管溫度為250 ℃;掃描方式為Full MS/ddMS2;一級掃描范圍：m/z 100～1 000;一級掃描分辨率70 000;AGC target：1e6;Maximum IT：100 ms;二級掃描分辨率：17 500;AGC target：1e5;Maximum IT：50 ms;NCE：20 eV、40 eV、60 eV。

1.3.3 前處理條件

準確稱取混勻后的保健酒樣品1 g（精確至0.01 g）于50 mL容量瓶中，加適量80%乙腈水溶液，渦旋混勻，超聲15 min，放冷至室溫，用80%乙腈水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，供DART-Q-Orbitrap HRMS檢測。

2 結果與分析

2.1 樣品傳輸速率

本試驗將樣品傳輸速率分別設置為0.2 mm/s、

0.3 mm/s、0.4 mm/s、0.5 mm/s和0.6 mm/s，對濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標準工作溶液進行測定。樣品傳輸速率在0.2～0.6 mm/s范圍內，離子響應強度隨著樣品傳輸速率的增大逐步降低。這是因為樣品傳輸速率越大，目標化合物與離子化氣體接觸越不充分，離子化效率較低，離子響應強度也隨之降低。因此，綜合離子響應強度、峰形等因素，最終選擇樣品傳輸速率為0.2 mm/s。

2.2 離子化溫度

本試驗以50 ℃為步長，在250～550 ℃范圍內，對濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標準工作溶液進行測定。在250～400 ℃范圍內，離子響應強度隨著溫度的升高而增強，當溫度高于400 ℃后，離子響應強度隨著離子化溫度的升高而降低。因此，最終選擇400 ℃作為離子化溫度。

2.3 柵極電壓

本試驗考察柵極電壓在250～500 V范圍內，以50 V為步長，對濃度為1.0 mg/L的12種PDE5抑制劑混合標準工作溶液進行測定。在250～400 V

范圍內，離子響應強度隨著柵極電壓的增大而增強;當柵極電壓大于400 V后，離子響應強度隨著柵極電壓的增大而降低。因此，最終柵極電壓選擇為400 V。

2.4 定性過程

LC-MS/MS法通常利用保留時間、離子對豐度比等信息進行定性，而Q-Orbitrap HRMS測得的一級精密質量數即可作為定性的依據[6]。12種PDE5抑制劑的一級精密質量數理論值與試測值之間的相對質量偏差在0.02～1.89 ppm范圍內，均小于5.0 ppm，滿足定性需求。本研究同時采集了二級特征碎片離子信息，通過一級質譜信息與二級特征碎片離子信息相結合的方式，實現精準定性。12種PDE5抑制劑的質譜分析參數見表1。

2.5 檢出限

通過在空白保健酒基質中添加不同濃度水平的12種PED5抑制劑混合標準溶液，確定各個物質的檢出限。如表2所示，12種PDE5抑制劑檢出限在0.03～2.50 mg/kg范圍內，滿足篩查的需求。

2.6 市售樣品的檢測

采用本文建立的方法對市售的10批次保健酒樣品進行檢測，每個樣品重復3次進樣，采用一級提取離子圖和一級精密質量數對樣品中可能添加的12種PDE5抑制劑進行初步定性篩查，若出現可疑樣品，結合二級特征碎片離子進行進一步確證。篩查結果發現1批次鹿尾巴酒為西地那非陽性樣品。采用國家現行食品補充檢驗方法--BJS 201805 食品中那非類物質的測定（第一法）進行檢測。結果表明，該批次鹿尾巴酒為西地那非陽性樣品，含量為681 mg/kg。

3 結論

本研究將DART與Q-Orbitrap HRMS兩者優勢相結合，建立了一種保健酒中12種PDE5抑制劑快速篩查與精準定性的檢測方法。該方法無需色譜分離過程，分析速度快，有機試劑消耗量少，綠色環保。此外，Q-Orbitrap HRMS通過一級全掃描獲得12種PDE5抑制劑的一級精確質量數，同時以數據依賴性二級掃描模式獲得的二級特征質譜信息為基礎，構建了12種PDE5抑制劑質譜數據庫，此數據庫作為自建數據庫可不斷擴充，為實現保健酒中非法添加化學藥物的快速篩查和精準定性提供數據支撐。本方法能夠快速、準確、高效地完成保健酒中12種PDE5抑制劑的快速篩查和精準定性，為維護保健酒行業的健康發展和保障我國食品安全提供技術支持。

參考文獻

[1]劉正才，陳章捷，郭菁，等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定保健酒中14種黃酮類成分的含量[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（7）：2178-2184.

[2]王玉潔，王倩，胡正偉，等.淺析中國保健酒市場的現狀及應用前景[J].農產品加工，2019（11）：89-90.

[3]劉子雄，黃景輝，譚貴良，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定保健食品中78種非法添加化學藥物[J].現代食品科技，2020，36（12）：283-292.

[4]孫健，胡青，張甦，等.超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定保健食品中30種非法添加壯陽類化合物[J].分析測試學報，2018，37（4）：419-426.

[5]朱燕燕，馬桂娟，龔慧.HPLC-MS/MS法同時測定保健食品中11種壯陽類非法添加[J].食品工業，2020，41（1）：315-318.

[6]國家市場監督管理總局.BJS 201805食品中那非類物質的測定[EB/OL].（2018-07-17）[2021-09-24].https：//www.doc88.com/p-7877817926821.html.