HPLC法測定陜北地區(qū)甜菊葉中甜菊糖苷含量

祁春雷 劉月霞 高強 文鈺

摘 要：采用HPLC法測定陜北地區(qū)佳縣、定邊、米脂3個產(chǎn)地的甜菊葉樣品中甜菊糖苷含量。通過超聲提取得到甜菊葉中甜菊糖苷樣品液，使用高效液相色譜儀檢測甜菊糖苷樣品液。采用C18反相色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 m），流動相為乙腈-磷酸鈉緩沖液（30∶70，體積比），梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，測定波長210 nm，進樣量10 μL。結(jié)果表明，HPLC法操作簡便、高效快速、穩(wěn)定性好。

關(guān)鍵詞：甜菊葉;甜菊糖苷;高效液相色譜法

Determination of Stevioside in Stevia Leaves in Northern Shaanxi by HPLC

QI Chunlei， LIU Yuexia， GAO Qiang， WEN Yu

（Yulin Heli Biotech Co.， Ltd.， Yulin 719000， China）

Abstract： The content of stevioside in Stevia leaves from Jiaxian， Dingbian and Mizhi in Northern Shaanxi was determined by HPLC. Stevioside sample solution in Stevia leaves was obtained by ultrasonic extraction， and stevioside sample solution was detected by high performance liquid chromatography. HPLC was performed on a C18 reversed-phase column （250.0 mm × 4.6 mm， 5 m）， the mobile phase was acetonitrile sodium phosphate buffer （30∶70， volume ratio）， gradient elution， flow rate was 1 mL/min， column temperature was 40 ℃， determination wavelength was 210 nm， and injection volume was 10 μL。 The result showed that the HPLC method was simple， efficient， rapid and stable.

Keywords： stevia leaves; stevioside; high performance liquid chromatography

甜菊葉屬菊科，又名甜菊葉、甜草，是一種多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲巴拉圭巴西交界的阿曼山脈。甜菊糖是從甜菊葉中提取出的含甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B等9種甜味成分的四環(huán)二萜類化合物，其中，瑞鮑迪苷A甜菊苷含量最高，甜味品質(zhì)最好，甜度是蔗糖甜度250～350倍，而熱量僅為蔗糖的1/300。2008年末甜菊糖被美國食品藥品管理局（FDA）批準使用，被譽為世界“第3類糖源”[1]。甜菊糖苷因其甜度高、熱量低、無毒性、耐高溫、耐酸堿和水溶性好，攝入人體后不被吸收，不產(chǎn)生熱量等優(yōu)點，被稱為是天然、健康的新型無熱量代糖產(chǎn)品，是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。可用于糖果、糕點、飲料、固體飲料、油炸小食品、調(diào)味料和蜜餞等食品加工領(lǐng)域。

目前關(guān)于甜菊葉中甜菊糖苷的測定方法有質(zhì)量法、堿量法、分光光度法和薄層色譜法等。本試驗擬采用高效液相色譜法對佳縣、定邊、米脂3個產(chǎn)地的甜菊葉樣品進行甜菊糖苷檢測，并分析甜菊葉里甜菊糖苷混合物中不同甜菊糖苷的含量，以期為甜菊葉質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3份相同品種甜菊葉樣品采于佳縣、米脂、定邊等地的農(nóng)業(yè)企業(yè)或種植基地。乙腈、磷酸二氫鈉、磷酸，均為色譜純。磷酸鈉緩沖液（pH2.6）：稱取1.20 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4），溶于800 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.6。流動相：乙腈-磷酸鈉緩沖液（30∶70，體積比）。

甜菊苷標(biāo)準品：甜菊苷含量（質(zhì)量分數(shù)，以干基計）≥99.0%。瑞鮑迪苷A標(biāo)準品：瑞鮑迪苷A含量（質(zhì)量分數(shù)，以干基計）≥99.0%。其他7種糖苷標(biāo)準品（質(zhì)量分數(shù)，以干基計）≥99.0%：瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊雙糖苷。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（日本島津公司產(chǎn)品）;紫外檢測器;電子天平;超聲波清洗儀（上海杰理科技有限公司產(chǎn)品）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

C18反相色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈：磷酸鈉緩沖液=30∶70，梯度洗脫，流速1 mL/min;柱溫40 ℃;紫外檢測器波長為210 nm，進樣量10 μL。

1.3.2 標(biāo)準品溶液制備

將甜菊糖苷標(biāo)準品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，精密稱取5 mg，溶液溶解并定容至10 mL，搖勻置于棕色瓶中。即配成濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。吸取10 μL標(biāo)液進樣，并記錄。

1.3.3 供試樣品溶液的制備

將3份甜菊葉樣品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，粉碎后分別稱取1 g放入燒杯中加入100 mL純凈水置于超聲波清洗器中60 ℃超聲提取1 h，高速離心20 min，收集過濾液并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，得到備用樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度實驗結(jié)果

取上述佳縣供試樣品溶液連續(xù)進樣3次，進樣量為10 μL，記錄峰面積，計算甜菊苷（Stevioside，ST）、瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）、瑞鮑迪苷B（Rebaudioside B，RB）、瑞鮑迪苷C（Rebaudioside C，RC）、瑞鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）、瑞鮑迪苷F（Rebaudioside F，RF）、杜克苷A（DulcosideA，DA）、甜茶苷（Rubusoside，RUB）和甜菊雙糖苷（Steviolbiosid，SB）的相對標(biāo)準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）值分別為2.15%、2.23%、1.98%、2.13%、2.02%、1.89%、1.99%、2.10%和2.11%，表明HPLC法測定甜菊糖苷含量精密度良好[2]。

2.2 甜菊葉中甜菊糖苷含量

佳縣、定邊、米脂甜菊葉中甜菊糖苷的色譜圖如圖1～圖3所示，具體含量見表1。甜菊葉中ST和RA含量占甜菊糖苷總量的比例是評價甜菊葉質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。表1結(jié)果顯示，3個地區(qū)的總苷含量在15.20%～17.51%，其中米脂的總苷含量最高，定邊的總苷含量最低[3]。不同地區(qū)各種成分含量差別比較大的是RA含量和RUB含量，其中，RA含量米脂最高、佳縣次之、定邊最低;RUB含量米脂最高、定邊次之、佳縣邊最低，米脂的RUB含量是佳縣的4倍[4]。

影響甜菊葉中甜菊糖苷含量的主要因素是溫度、光照、生長周期[5]。定邊甜菊葉種植在風(fēng)力發(fā)電設(shè)備下，種植基地相對于佳縣和米脂海拔高、溫度低，導(dǎo)致甜菊葉的生長周期縮短，RA含量和總苷含量較低。而米脂種植基地在太陽能發(fā)電光板下，地勢平坦、溫度較其他兩地高，但光照不足，影響了甜菊葉的質(zhì)量。佳縣是大面積、大規(guī)模平地種植，正常光照和溫度，其RA占總苷含量最高。

3 結(jié)論

HPLC法測定甜葉菊中甜菊糖苷含量精密度良好，且能同時測定甜葉菊中甜菊糖苷總量及9種成分，包括甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷的含量，為不同地區(qū)甜葉菊質(zhì)量評價提供了一種操作簡便、高效快速的檢測方法。

參考文獻

[1]羅慶云，印敏，陳玉江，等.酸性氧化鋁前處理甜葉菊葉片甜菊糖苷分析樣品的質(zhì)譜驗證[J].中國糖料，2019，41（4）：24-29.

[2]安徽蚌埠惠農(nóng)甜葉菊高科技發(fā)展有限公司.一種大量獲得甜葉菊葉片產(chǎn)物甜菊糖苷RM的方法：201810683979.5[P].2018-11-30.

[3]洪維廉，陳睦傳，李里焜，等.甜葉菊甙研究的進展[J].植物科學(xué)學(xué)報，1987，5（3）：211-218.

[4]明光市大全甜葉菊專業(yè)合作社.一種提高甜葉菊中甜菊糖苷含量的方法：106631356A[P].2017-05-10.

[5]鄧佐，夏延斌，王曉亮.簡易HPLC法測定甜菊葉中甜菊糖苷[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊（下），2013（10）：14-15.