不同老化方式的滸苔生物炭對養殖底泥中復合污染物的修復研究

趙漢胤，張麗，于紋鑒，陳以芹，余晏璐，李娟英

（上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306）

作為污染物的源和匯的養殖底泥污染已有較多報道[1-2]，且養殖底泥污染與養殖水產品的質量息息相關[3]。曹菊花等[4]對洞庭湖水產品中重金屬的污染現狀以及來源進行分析，發現As、Cd和Hg元素已超國家三級土壤標準且可能會影響水生生物的健康；謝文平等[5]的研究表明珠江三角洲養殖魚塘底泥中重金屬的生態風險等級為中等，說明該地區重金屬污染會對水產品產生潛在毒性危害。本課題組近年來對長三角地區養殖池塘底泥和水產品中污染物的調查與研究表明[6-7]，該地區的養殖水產品中重金屬和有機物殘留情況普遍存在，尤其以重金屬和多環芳烴（PAHs）的檢出頻率較高。因此，對養殖池塘底泥的復合污染（重金屬和PAHs）進行修復控制以保障水產品質量是非常必要的。

受污染底泥的修復方法主要有物理法、化學法及生物法，其中生物法的修復周期較長，且易受溫度、氣候等條件的影響，物理法存在處理成本高、破壞原有生態系統等問題，而化學法中的吸附法，則由于其穩定、高效的特點，應用較為廣泛。生物炭作為一種新型修復材料，因其制作工藝簡單、修復效果好、價格低廉，已被逐漸應用到受污染的水體治理和底泥修復等領域。大量研究表明，生物炭能夠修復受重金屬[8]以及PAHs污染的土壤[9]。在修復重金屬時沉淀作用占主導地位[10]，而沉淀作用則是取決于生物炭的灰分含量。因此，炭基材料的不同對于生物炭的吸附性能及修復潛力的影響巨大，通常具有較高灰分含量的生物炭對重金屬有較好的吸附固定能力。滸苔是一種海洋大型海藻，其在中國部分海域的大規模暴發嚴重破壞了海洋生態系統，威脅沿海漁業及旅游業的發展，而利用滸苔制成的生物炭具有較高的灰分含量[11]，已被證明對重金屬和PAHs有良好的去除效果[12]，若將其作為修復材料不僅可以穩定化底泥中的污染物，同時也可實現滸苔資源化利用，解決滸苔暴發造成的環境問題。

本研究以養殖水產品和底泥中檢出頻率較高的重金屬Cu、Pb、Cd、Cr和PAHs為研究對象，選擇菲律賓蛤仔（R.philippinarum）作為受試生物，在實驗室開展靜態修復實驗，將熱解老化后的滸苔生物炭加入受污染的底泥中，并通過生物累積實驗評估該材料的修復效果。旨在探討：（1）熱解過程對滸苔生物炭中固有PAHs含量的影響；（2）老化滸苔生物炭的添加對降低生物體內重金屬和PAHs的累積效果；（3）老化滸苔生物炭添加對水產品食用健康風險的影響，以期為養殖底泥原位修復和水產品質量的提高提供實驗依據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甲醇、二氯甲烷、丙酮和正己烷等有機溶劑均為色譜純（Sigma-Aldrich）；乙腈為色譜純（沃凱試劑，中國）；過氧化氫（30%）、硫酸、無水硫酸鈉、氧化鋁、硅膠、佛羅里硅土和銅片等為分析純，均購自國藥集團。無水硫酸鈉、佛羅里硅土、層析硅膠和氧化鋁分別在馬弗爐中450、650、650℃和400℃下灼燒6 h，冷卻后轉移到干燥器中保存待用；重金屬Cu、Pb、Cd和Cr標準液購自國家標準物質研究中心（GSB04-1767-2004）；PAHs標準物質購自Sigma-Aldrich公司（NIST1647F），4℃冰箱中保存待用。

1.2 生物炭的制備及老化

制備：滸苔（Enteromorpha）采自江蘇如東沿岸，用蒸餾水洗凈，在85℃烘箱中烘干，粉碎過100目篩，置于450℃的馬弗爐（KSL-1200X-H）中碳化2 h，碳化期間持續通入氮氣以保證限氧環境，該條件是本課題組前期研究污染物去除率所得的最優結果。

熱解：將制得的滸苔生物炭再置于200℃烘箱中熱解24 h，自然冷卻至室溫后保存于干燥器中。

老化：選擇自然老化與凍融循環老化兩種方法。自然老化：將熱解后的滸苔生物炭放入密閉容器內，置于4℃冰箱中，避光老化28 d；凍融循環老化：將熱解后的滸苔生物炭放入密閉容器中并與水以1∶5的比例混合，在-20℃的冰箱中放置24 h，然后在20℃的冰箱中放置24 h，循環28 d[13-14]。收集老化后的滸苔生物炭，粉碎過100目篩進行進一步表征（表1）和實驗。

1.3 沉積物的采集與準備

利用彼得森采泥器采集上海東海魚塘表層底泥，置于放有冰袋的保溫箱中帶回實驗室。稱取底泥樣品2 kg（濕質量）放入5 L玻璃罐中。根據本課題組之前的研究結果[15]，按3%的干質量比加入上述兩種老化后的滸苔生物炭并攪拌均勻，4℃避光保存28 d后用于生物累積實驗。實驗共分為3組，自然老化組、凍融循環老化組以及空白對照組，每組設置兩個平行。

1.4 生物累積實驗

實驗中所用的菲律賓蛤仔購自上海市蘆潮港水產市場，選取個頭大小相近的蛤仔[殼長（32±2）mm、殼高（12±2）mm]運回實驗室后，在鹽度（25±2）和水溫（20±1）℃且連續曝氣的條件下馴養3周以上。馴養過程中光照16 h，黑暗8 h，每天定時投加定量三角褐指藻喂養。在馴養結束后、累積實驗前，對菲律賓蛤仔體內重金屬和PAHs背景值進行分析，結果表明污染物的背景值均為Nd（未檢出）。生物累積實驗參照EPA方法（EPA 600∕R-99∕064），稱取老化后的底泥約2 kg（濕質量）放入30 cm×20 cm×20 cm玻璃缸中，并在底泥表面覆蓋6 L左右的人工海水（按照ISO-10253用海水素和蒸餾水配制）。靜置24 h后，于每個玻璃缸中放入馴養后的蛤仔30只，進行持續28 d的生物累積實驗。

1.5 重金屬預處理及測定

取0.1 g冷凍干燥的蛤仔肌肉，過50目網篩后置于50 mL燒杯中，加入幾滴純水潤濕，再加2 mL硝酸，蓋上培養皿于電熱板上加熱至氣泡消失。取下燒杯加入0.5 mL過氧化氫（30%），蓋上表面皿后繼續加熱20 min，再補加1 mL過氧化氫加熱蒸發至溶液剩余1 mL。繼續向燒杯中加1 mL硝酸和1.5 mL過氧化氫并使溶液蒸至剩余0.5 mL，再全量轉入10 mL具塞比色管中加純水定容至刻度線用于Cu、Pb和Cd的測定；重金屬Cr的測定需取0.2 g冷凍干燥的蛤仔肌肉，消解方法同上，但在持續加熱20 min后需補加1.5 mL過氧化氫，在全量轉入比色管之后需加1 mL抗壞血酸溶液再定容至刻度線，經由0.22 μm玻璃纖維膜過濾后上機測定。所有重金屬溶液樣品用TAS990原子吸收分光光度計測定。

1.6 PAHs預處理及測定

取0.3 g冷凍干燥蛤仔肌肉，過50目網篩后置于微波萃取管中并加入12 mL二氯甲烷，萃取2 h，將萃取液吸取到10 mL玻璃離心管內，再用5 mL二氯甲烷溶液洗滌萃取管兩次，同樣吸取到10 mL玻璃離心管內。將兩次10 mL溶液氮吹合并至近干后加4 mL乙腈，使用旋轉蒸發儀（RE10-50，上海百申儀器設備有限公司）漩渦振蕩1 min，再向上述溶液中加入4 mL乙腈飽和的石油醚[乙腈∶石油醚（V∕V）=1∶5]，使用旋轉蒸發儀漩渦振蕩1 min，在3 000 r·min-1的條件下離心30 min后，去除上層油脂，余下部分用氮吹儀吹至近干，再加2 mL二氯甲烷。用活化銅和Florisil柱凈化上述溶液，并用10 mL二氯甲烷洗脫，最后將洗脫液用氮氣吹至近干，用乙腈定容至0.5 mL，待上機測定。所有PAHs樣品用氣相色譜-質譜法（GC-MS，Agilent 7890B∕5975C）測定。

1.7 食用風險計算

1.7.1 重金屬目標危險系數計算

重金屬的健康風險評價采用目標危險系數法[16]（THQ），計算公式如下：

單一重金屬風險計算公式：

多種重金屬復合風險計算公式：

式中：EF為重金屬的暴露頻率，365 d·a-1；ED是暴露期限，30 a；IR是攝入速率，蛤仔為48.9 g·d-1[17]；C為水產品中重金屬含量，μg·g-1dw；RfD是口服參考劑量，Cu、Pb、Cd、Cr分別是 4×10-2、4×10-3、1×10-3、1.5 μg·g-1·d-1；BW是體質量，70 kg；AT是平均年齡，70 a。

1.7.2 PAHs的致癌風險計算

PAHs的致癌風險用ILCR（Incremental lifetime cancer risk）進行計算：

式中：BaPeq是PAHs的BaP毒性當量濃度，Ci是每種致癌PAHs單體的濃度；TEFi是每種致癌PAHs單體相對于BaP的毒性因子（表2）。

式中：CSF為致癌斜率因子，7.3 mg·d·kg-1。

1.8 質量控制與保證

為保證實驗結果的準確性和科學性，所有樣品設定兩個平行樣，污染物濃度測定結果用平均值±標準偏差表示，蛤仔體內重金屬和PAHs測定的檢出限及回收率見表3和表4。本文圖表制作及數據分析均采用Prism 8.0完成。

表2 毒性當量因子（TEFs）Table 2 BaP toxicity equivalent factor（TEFs）

2 結果與討論

2.1 生物炭的熱解

有研究表明，生物炭在制備過程中會產生PAHs[18]，向底泥中施加生物炭可能會導致底泥中PAHs含量的增加，產生負面影響。而Ko?towski[19]等發現，通過對成品生物炭高溫熱解可顯著降低其中PAHs的含量。本研究中未熱解前的滸苔生物炭中PAHs的含量達到了3 865 ng·g-1dw（表5），其中低環PAHs（2環和3環）占ΣPAHs含量的92%。生物炭在制備過程中需通入N2以達到限氧環境，在該條件下制備的生物炭主要生成的是低環和中環PAHs[20]，故其占比最高，這也與羅飛等[21]研究結果相一致。本實驗所用養殖池塘底泥的∑PAHs含量為400 ng·g-1dw（表5），若將未熱解的滸苔生物炭直接施入底泥則會加重底泥PAHs的污染。而經200℃熱解24 h后的成品滸苔生物炭，PAHs受熱脫附，其ΣPAHs的含量顯著降低至560 ng·g-1dw，去除率為86%。已有的研究表明，生物炭中的PAHs能與生物炭緊密結合，其生物利用度較低[22]，且根據《European Biochar Certificate》（EBC）的規定，優質生物炭中16種PAHs的總和不應超過4 mg·kg-1dw，故本文所使用的滸苔生物炭經熱解后可以在養殖池塘底泥中安全使用。

表3 蛤仔體內重金屬測定的檢出限與回收率Table 3 Detection limits and recoveries of the heavy metals in R.philippinarum

表4 蛤仔體內PAHs測定方法的檢出限與回收率Table 4 Detection limits and recoveries of PAHs in R.philippinarum

2.2 不同老化過程對底泥中復合污染物生物累積的影響

2.2.1 重金屬的生物累積

生物炭的老化通常會導致其表面發生改變。已有的研究表明，老化后生物炭表面的含氧官能團會增多，而含氧官能團可以為重金屬的吸附提供有效的吸附點位，且生物炭老化會導致其表面原有的可溶性有機物釋放，增加其吸附能力[23]。此外，老化滸苔生物炭對底泥進行修復需要一個合適的評價方法，菲律賓蛤仔可用作評估底泥污染狀況的指示生物[24]。因此本研究通過對蛤仔體內重金屬濃度的分析來評價生物炭對底泥的修復效果。

表5 熱解前后滸苔生物炭中PAHs的含量（ng·g-1dw）Table 5 Contents of PAHs in Enteromorpha biochar before and after pyrolysis（ng·g-1dw）

生物累積實驗結束后，自然老化組和凍融循環組蛤仔體內的4種重金屬累積濃度均有不同程度的降低（圖1）。與對照組相比，自然老化組蛤仔體內Cu的累積濃度從25.96 μg·g-1dw下降至18.17 μg·g-1dw，Pb、Cd和Cr的含量也從6.05、1.78、6.27 μg·g-1dw分別下降至3.57、0.84、3.57 μg·g-1dw。總體來說，自然老化組蛤仔體內重金屬Cu、Pb、Cd和Cr的累積濃度分別減少了30%、41%、53%和43%，均達到極顯著差異水平（P＜0.01）。凍融循環組蛤仔體內Cu、Pb、Cd、Cr的濃度分別下降至22、4.6、1.3、5.0 μg·g-1dw，分別下降了16%、24%、27%、21%，除Cr外，其余均達到了顯著差異水平（P＜0.05）。與凍融循環老化后的滸苔生物炭相比，自然老化組的效果較好，這可能是由于凍融循環老化過程中溫度變化，導致生物炭表面性質發生了劇烈改變，如表面孔隙結構坍塌導致吸附點位的減少[25]，且凍融循環老化還可能會導致生物炭的灰分含量減少（表 1）[26]，而灰分的主要成分為 Na+、K+、Ca2+、Mg2+等礦物組分，生物炭中的這些元素可與重金屬進行離子交換以達到固定重金屬的效果。因此，凍融循環使得生物炭與重金屬的離子交換能力減弱，致使其在吸附固定底泥中重金屬時比自然老化的滸苔生物炭的效果差。

圖1 菲律賓蛤仔體內重金屬的濃度Figure 1 Concentrations of heavy metals in R.philippinarum

但總體上，生物炭表面含有的豐富的含氧官能團能對重金屬產生絡合作用，變成金屬絡合物，且生物炭表面存有的吸附點位能夠吸附固定底泥中的重金屬。此外，由于生物炭呈堿性，其也會與重金屬產生共沉淀作用，使底泥中的重金屬被固定在生物炭上，減少了向蛤仔體內的遷移，因此實驗組中蛤仔重金屬累積濃度較對照組明顯下降，說明添加滸苔生物炭能有效控制并顯著降低底泥中重金屬的生物有效性。

與Pb、Cd、Cr相比，Cu的下降率相對較低，這可能是由于Cu是維持生物體正常生命活動必不可少的元素之一，因此生物炭的添加對其影響較小。Wang等[27]的研究也發現，向土壤中添加生物炭對降低毛竹根、莖、葉中Cu的累積濃度并不顯著。此外，底泥中重金屬的存在形態也會影響重金屬的下降率，因為生物炭的添加可以降低底泥中重金屬的遷移率，提高其穩定性，但對不同重金屬遷移率的影響并不一致[28]。

2.2.2 PAHs的生物累積

生物炭除了能吸附固定重金屬，對PAHs等疏水性有機污染物也具有良好的修復效果。生物累積實驗結束后，對照組中蛤仔體內∑PAHs的含量為371 ng·g-1dw（表6），環數分布以3～4為主（圖2），5～6環次之，主要單體污染物為PHE、BkF、BPF。在向底泥添加生物炭后，自然老化組和凍融循環組中蛤仔體內∑PAHs的含量分別下降至267 ng·g-1dw和337 ng·g-1dw，環數仍以3～4環為主，但主要單體污染物PHE、BkF、BPF均有所下降（表6）。其中，3～4環PAHs下降較明顯（P＜0.05），而高環（5～6環）PAHs的下降并不顯著。一般認為，生物炭對低分子量PAHs的吸附能力更好，因此能對底泥中低環的PAHs進行有效吸附固定，而5環和6環PAHs與底泥的結合能力較強，添加生物炭對其修復作用較弱[29]。

圖2 生物累積實驗結束后生物體內PAHs的環數分布Figure 2 Distribution of PAHs in organisms after the bioaccumulation experiment

表6 生物累積實驗結束后生物體內PAHs的總量（ng·g-1dw）Table 6 Total PAHs in the organism after bioaccumulation experiment（ng·g-1dw）

與凍融循環老化組相比，自然老化組蛤仔體內累積的∑PAHs含量降解較明顯，這可能是由于凍融循環后滸苔生物炭中的O含量增加而C含量降低（表1），滸苔生物炭的O∕C增加，即極性增加、親脂性減弱，使得凍融循環后的滸苔生物炭對PAHs的吸附固定能力減弱，因此造成凍融循環老化的滸苔生物炭對降低蛤仔體內累積的ΣPAHs效果不明顯[30]。

2.3 不同老化滸苔生物炭添加對蛤仔食用風險的影響

2.3.1 重金屬的目標危險系數

生物炭添加前后菲律賓蛤仔體內重金屬的目標危險系數（THQ）的計算結果如表7所示。對照組蛤仔體內4種重金屬的復合目標危險系數（THQs）大于1，表明長期食用此種水產品會存在潛在的非致癌風險。而當向底泥中添加兩種不同老化方式的滸苔生物炭后，4種重金屬的ΣTHQs值分別下降至0.70和0.91，下降了42%和24%，達到顯著相關水平（P＜0.05）。Nisar等[31]的研究結果也表明，向受污染的土壤添加生物炭，使小麥籽粒對成年人和兒童的重金屬危害風險指數下降至安全范圍內。其中Pb和Cd的THQ對ΣTHQs的貢獻達到80%，為主要風險貢獻元素，這與前人的研究一致[32]。因此，通過在底泥中添加生物炭可控制底泥中重金屬在生物體內的累積并顯著降低水產品的食用風險。

表7 各組底泥中菲律賓蛤仔的重金屬目標危害系數Table 7 Target hazard quotient of heavy metals of R.philippinarum in different groups of sediments

2.3.2 PAHs的致癌風險

潛在的致癌性 PAHs（BaA、BbF、BkF、BaP、DBA和IPY）在對照組中的總濃度為124 ng·g-1dw（表8），而在底泥中添加兩種不同老化方式的滸苔生物炭后，生物體內致癌性PAHs的濃度分別下降至69 ng·g-1dw和115 ng·g-1dw。根據公式（4）計算累積實驗結束后蛤仔體內PAHs的致癌風險ILCRs可知，自然老化和凍融循環老化分別可使PAHs的致癌風險下降35%和15%，達到顯著差異水平（P＜0.05）。這與Ali等[33]得出的結論相似，他們利用生物炭修復受OCP污染的土壤，使蔬菜對成人和兒童的平均致癌風險顯著降低。

3 結論

（1）在450℃限氧炭化2 h制備的滸苔生物炭繼續熱解可減少86%的殘留PAHs，并達到EBC標準。

（2）生物累積實驗結果表明，向底泥中添加自然老化的滸苔生物炭使蛤仔體內重金屬Cu、Pb、Cd、Cr和PAHs分別下降30%、41%、53%、43%和28%，其效果顯著優于凍融循環老化的滸苔生物炭，主要原因是不同老化方式使滸苔生物炭的理化性質發生了改變。

表8 PAHs的致癌風險（ILCR）Table 8 Incremental lifetime cancer risk（ILCR）of PAHs

（3）自然老化和凍融循環老化的滸苔生物炭均可對受重金屬和PAHs污染的養殖底泥進行修復，但在實際效果方面，應選自然老化的滸苔生物炭為宜。