EB病毒EA優勢表位區段抗原的克隆表達及其鼻咽癌診斷價值初步評價

陳世鋒，胡紀文，殷瑛，杜江東，唐倩青，伊茂禮，王學波，張玲，危利，孫成銘

1.煙臺毓璜頂醫院 檢驗科，山東 煙臺 264000；2.羅湖醫院集團 醫學檢驗中心，廣東 深圳 518001；3.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071；4.東方海洋（北京）醫學研究院，北京 100071

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是能普遍感染人類的DNA皰疹病毒，易感染B淋巴細胞，機體感染EB病毒后可誘發多種疾病，與其相關的惡性腫瘤包括血液系腫瘤和非血液系惡性腫瘤。在國際癌癥研究中心1999年致癌因子的分類標準中，EB病毒已被明確列為第1類致癌物，尤其是鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）。NPC是發生于鼻咽黏膜的惡性腫瘤，是第一個被發現與EB病毒感染密切相關的人類癌癥，大部分角化鱗狀細胞癌和幾乎所有未分化的鱗狀細胞癌都有EB病毒的存在[1-2]。NPC在世界大部分地區是一種罕見腫瘤，發病率不到1/10萬。但是，約80%的鼻咽癌發生在中國，尤其是廣東省，成為一種區域性的高發腫瘤，發病率高達（15～50）/10萬，每年最少有80 000例新患者，死亡率達（10～13）/10萬，因此我國已將鼻咽癌列為重點預防和治療的惡性腫瘤之一[3]。

血清學改變在NPC發展過程中是一個普遍和早期的事件，很可能發生在疾病從浸潤前期到浸潤期的進展過程中。EB病毒感染人后在不同的周期產生不同的抗原，包括潛伏期的核心抗原（EBNA），溶解期的衣核抗原（VCA）、早期抗原（EA）、膜抗原（MA），以及從潛伏期激活轉化為溶解期的立即早期抗原Rta和Zta。EB病毒感染患者血清中存在大量針對不同抗原的抗體，因而針對EB病毒不同抗原的特異性抗體成為NPC早期診斷的重要標志物[4]。早期抗原（early antigens，EA）抗體的出現提示體內EB病毒復制開始，幾乎不在正常人群和鼻咽癌以外的其他腫瘤患者中出現。為了進一步提高國產EA抗體檢測試劑的性能，本研究中，我們利用生物學軟件分析EA氨基酸序列的B細胞表位分布及疏水性，選取含有優勢表位的抗原區段進行克隆表達，并對其診斷價值進行了初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

52例經臨床病理確診的NPC患者血清標本和95例健康體檢者血清樣本由煙臺毓璜頂醫院檢驗科和羅湖醫院集團醫學檢驗中心提供，保存于-80℃備用。

B95-8細胞株、質粒pBVGST-6His為本室保存；T4DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；FastStart High Fidelity PCR System購自Roche公司；DNA限制內切酶XhoⅠ、XbaⅠ購自Promega公司；HRP標記的抗人IgG、IgM和IgA二抗購自Bethyl公司。

1.2 EA蛋白抗原性分析及優勢表位區段篩選

采用BIOSUN生物信息學軟件分析EB病毒EA蛋白氨基酸序列，首先輸入全長序列，然后利用B細胞表位分析功能，根據表位峰值的高低篩選確定優勢表位區段。

1.3 EA優勢表位區段抗原基因克隆與表達

提取含EB病毒的B95-8細胞株總RNA，逆轉錄合成cDNA，以其為模板，針對不同區段設計EA優勢表位區段抗原基因的擴增引物EA61-F（GCCTCGAGTTCGAGGTCTCCCCTGACGCTGTGGC CGA）、EA61-R（GCTCTAGATTAATACGTGGTGAC GTAGAGATCCGGATT）、EA291-F（GCCTCGAGAG TGTTATTTTATTTAACCACGCCT）、EA291-R（GCT CTAGATTAAATGAGGGGGTTAAAGGCCTGCTT）。

引物合成及序列測定由中美泰和生物技術有限公司完成。以cDNA為模板，PCR擴增獲得目的基因片段（擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環；72℃延伸 5 min）。將純化后的PCR產物連接pBVGST-6His表達載體進行測序，將含有正確目的基因的大腸桿菌菌株誘導表達。

1.4 抗原純化及制備

收集誘導表達后的菌體，超聲波破碎，從表達菌中提取包涵體，用25 mmol/L Tris-HCl重懸洗滌沉淀，加入β巰基乙醇沸水中煮5 min，收集樣品進行Ni柱純化。首先用平衡緩沖液（25 mmol/L TE，1% β巰基乙醇，6 mol/L尿素，pH8.5）平衡Ni柱，將粗提的包涵體加入Ni柱，用含25、250 mmol/L咪唑的洗滌液分別洗脫收集目的蛋白，最后進行15%SDS-PAGE鑒定。

1.5 間接ELISA法建立及抗原活性鑒定

分別用碳酸鹽包被緩沖液稀釋EA優勢表位區段抗原，濃度為 2.5 μg/mL，每孔包被 100 μL，4℃過夜；用洗液洗板 2次，200 μL/孔；加入 110 μL/孔封閉液室溫封閉6 h；用洗液洗板5次，200 μL/孔；每孔加入 200 μL 樣品稀釋液后，分別加入10 μL待測血清，室溫孵育30 min，棄液，用洗滌液洗板5次后棄液，拍干，加入100 μL/孔HRP標記的抗人IgG/抗人IgA/抗人IgM抗體，室溫孵育20 min；用洗液洗板5次，200 μL/孔；加新鮮配制的底物溶液，100 μL/孔，室溫避光孵育10 min；加入 50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應，采用酶標儀測定各孔的D450nm值。

1.6 統計學分析

運用GraphPad Prism 5軟件對檢測結果進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，繪制ROC曲線，以約登指數最大判斷Cut-off值（臨界值），≥Cut-off值判定為陽性，＜Cut-off值判定為陰性，并計算靈敏度與特異性。

2 結果

2.1 EB病毒EA優勢表位抗原區段的確定

利用BIOSUN生物學軟件尋找B細胞表位，根據表位分布圖確定EA優勢表位抗原區段分別為61～200 aa（EA1）和 291～404 aa（EA2）（圖 1）。

2.2 目的基因的克隆

以B95-8細胞株總RNA逆轉錄合成的cDNA為模板，PCR擴增出目的基因，2%瓊脂糖電泳鑒定結果顯示擴增片段分別約為420 bp（EA1）和339 bp（EA2）（圖 2）。

2.3 抗原表達、純化與鑒定

PCR產物純化后經雙酶切克隆至pBVGST-6His載體，構建表達質粒pBVGST-EA1和pBVGST-EA2，測序正確后轉化大腸桿菌誘導表達。EA1和EA2抗原均以包涵體方式表達，Ni柱純化后獲得純化抗原，電泳鑒定結果顯示EA1和EA2相對分子質量分別約為28.4×103和25.5×103（圖3）。

圖1 EB病毒EA抗原B細胞表位分析

2.4 抗原活性初步評價

圖2 PCR擴增產物電泳鑒定

圖3 EA優勢表位區段抗原的SDS-PAGE鑒定

表1 EA優勢表位區段抗原活性初步評價（D450nm）

隨機選取10份臨床病理確診的NPC患者血清標本（P1～P10）和10份健康體檢者血清樣本（N1～N10），間接ELISA 法檢測樣本，比較2種抗原的活性，結果見表1。IgG檢測，EA1優勢表位區段抗原檢出3份陽性樣本，EA2優勢表位區段抗原10份陽性樣本全部檢出；IgA檢測，EA1優勢表位區段抗原檢出2份陽性樣本，EA2優勢表位區段抗原10份陽性樣本全部檢出；IgM檢測，EA1優勢表位區段抗原未檢出陽性樣本，EA2優勢表位區段抗原檢出4份陽性樣本。2種優勢表位抗原對10份健康體檢者血清樣本均檢測為陰性。由此可以看出，EA2優勢表位區段抗原活性在IgG、IgA和IgM抗體檢測方面均顯著優于EA1優勢表位區段抗原；NPC患者血清中抗病毒早期抗原的IgG和IgA抗體陽性率顯著高于IgM抗體。

2.5 NPC患者血清中抗EA-IgG和IgA抗體檢測

采用活性好的EA2抗原包被酶聯板，通過間接ELISA法對全部52例經臨床病理確診的NPC患者血清標本和95例健康體檢者血清樣本進行抗EA抗原IgG和IgA抗體檢測，結果如圖4，NPC患者血清中抗EA-IgG水平和抗EA-IgA水平均顯著高于健康對照組。根據ROC曲線，抗EA-IgG診斷NPC的AUC值為0.972，抗EA-IgA診斷NPC的AUC值為0.893。對于抗EA-IgG檢測，以約登指數最大時的D450nm=0.446為臨界值，抗EA-IgG對NPC檢測的靈敏度為90.38%（47/52），特異性為93.68%（89/95）。對于抗EA-IgA檢測，以約登指數最大時的D450nm=0.079為臨界值，抗EA-IgA對NPC檢測的靈敏度為65.38%（34/52），特異性為95.79%（91/95）。

3 討論

晚期鼻咽癌患者病死率極高，5年生存率僅20%左右。即使生存，也因多次放療和化療帶來的嚴重不良反應而使患者無法同健康人一樣生活。相比而言，早期鼻咽癌治療效果好，5年生存率高于85%，放療和化療周期可以縮短而使患者少受不良反應之苦，可見鼻咽癌早期診斷是提高治療效果、降低病死率的最好方法。鼻咽癌患者一般平均在癥狀出現前3年血清EB病毒抗體水平呈持續升高，連續數年檢查EB病毒抗體陽性的患者，3年內發展為鼻咽癌者占18.5%，5年內發生鼻咽癌者為33.3%[5-8]。因此，任何一種抗體陽性的人群要定期追蹤復查，而2種或2種以上抗體持續陽性者屬于“高危人群”，尤應高度關注并進行進一步檢查。

圖4 EA優勢表位區段抗原血清學檢測性能

EB病毒裂解期依次表達Rta、EA和VCA抗原，其中EA出現是EB病毒活躍增殖的標志，與EB病毒感染進程緊密相關[9～11]。EA-IgA和VCAIgA抗體檢測已普遍應用于鼻咽癌篩查和輔助診斷[12]，在鼻咽癌流行地區聯合檢測2種抗體使得我國鼻咽癌的早期診斷率從20%～30%提高到80%～90%。但是，由于EA-IgA抗體陽性率較低，Sigel等[13]認為在鼻咽癌低發區EA-IgA對鼻咽癌診斷，特別是早期診斷無幫助。肖錫賓等[14]同樣認為，在鼻咽癌高發區EA-IgG與VCA-IgA聯合檢測比EA-IgA與VCA-IgA組合能篩查出更多的鼻咽癌患者。此外，多位學者發現鼻咽癌患者EA-IgG抗體陽性率高于EA-IgA抗體，認為EAIgG抗體是鼻咽癌篩查診斷的重要標志物[15-16]。

本研究為了獲得高活性EA抗原，通過生物學軟件分析選取了2個優勢表位區段抗原并獲得了高效表達，隨后經小樣本驗證，確定其中位于EA羧基端的優勢表位區段抗原EA2具有更好的檢測性能，既保證了抗原的活性，又具有較高的特異性。接下來放大樣本進行檢測，結果顯示基于本研究優勢表位區段抗原EA2所建立的EAIgG和抗EA-IgA檢測方法可以很好地區分NPC患者和健康對照，尤其是抗EA-IgG檢測的AUC值為0.972，具有優異的檢測性能。

在本研究中，抗EA-IgG（93.68%）和抗EAIgA（95.79%）檢測的特異性均較高，兩者之間比較無顯著性差異，但是在NPC患者中抗EA-IgG的陽性率（90.38%）卻顯著高于抗EA-IgA的陽性率（65.38%），這表明與抗EA-IgA相比，EA-IgG抗體也是診斷鼻咽癌的特異性標記物，而且具有更高的診斷性能。以往也有研究認為EA-IgA陽性在正常人群中罕見，具有很高的特異性，但靈敏度較低，因此多與VCA-IgA聯合使用[17-18]。根據本研究結果綜合考慮，抗EA-IgG比抗EA-IgA對NPC的鑒別診斷更有價值，在篩查方案中可以考慮用抗EA-IgG代替抗EA-IgA，與其他指標組合，提高診斷效率和篩查準確率。