蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的結構與生物相容性

王曙東， 馬 倩， 王 可,4， 瞿才新， 戚 玉

(1. 鹽城工業職業技術學院 紡織服裝學院， 江蘇 鹽城 224005； 2. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院， 江蘇 蘇州 215002；3. 江蘇金麥穗新能源科技股份有限公司， 江蘇 鹽城 224005； 4. 青島大學 紡織服裝學院， 山東 青島 262127)

組織工程支架材料融合了材料工程和生命科學的概念和創新，旨在解決組織的改進、修復和替換問題[1]。為成功地進行組織的修復和再生，支架材料應具有特定形狀、三維多孔結構和優異的生物力學特性，并可為細胞的附著、增殖和分化提供支持[2]。蠶絲蛋白因具有良好的生物相容性、生物可降解性以及最小的炎癥反應等優異性能，已被制備成多種結構和形態的支架材料，如水凝膠、納米纖維、薄膜、微球和管狀物等，并廣泛應用于組織工程的修復與再生[3-4]。目前，靜電紡絲法、自組裝法、相分離法、氣體發泡法、溶膠-凝膠法等技術已被廣泛應用于組織工程支架的制備[5]。除上述方法外，3D打印技術以其成型簡單、速度快、結構可控、制備工藝更清潔等特點，引起了研究人員的廣泛關注[6-8]。

近年來，國內外已有采用3D打印技術制備蠶絲蛋白支架的相關報道。SKANDER等[9]成功地在塑料基板上將蠶絲蛋白水溶液打印成平行線狀圖案，并將人體骨髓基質細胞種植于該蠶絲蛋白線上，結果表明，細胞可較好地在該蠶絲蛋白線上生長。GHOSH等[10]采用3D打印技術制備了格柵狀蠶絲蛋白支架材料，并將打印出的格柵狀蠶絲蛋白支架沉積到甲醇溶液中，通過有機醇交聯使蠶絲蛋白二級結構轉變，從而使蠶絲蛋白水溶液凝膠成型。上述研究表明，蠶絲蛋白已被作為3D打印的潛在材料，并應用于組織工程支架，然而3D打印制備蠶絲蛋白支架材料也面臨著挑戰，其中關鍵的問題是蠶絲蛋白的快速成型與凝固，因為快速成型是3D打印蠶絲蛋白支架材料的前提和基礎。

在課題組前期研究中，通過電凝膠法制備了蠶絲蛋白水凝膠，并通過有機醇處理和紫外光固化等方法研究了蠶絲蛋白水凝膠的快速成型[11]，但制備過程復雜，且有機醇和光固化劑等可能會對蠶絲蛋白支架材料造成污染。明膠是一種從膠原蛋白中提取的可生物降解的聚合物，其成分和生物特性與膠原蛋白幾乎相同，此外，在低溫環境下明膠可快速凝膠成型[12]，因此，本文將蠶絲蛋白與明膠復合，制備了蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠，通過明膠來調節蠶絲蛋白的快速成型，通過直寫擠出式3D打印技術制備了格柵狀蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架，并對其結構與性能進行了研究。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

蠶繭，市售；明膠粉(平均相對分子質量為25 000，化學純)，溴化鋰、碳酸氫鈉、無水乙醇、胭脂紅、苦味酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；透析袋(截留相對分子質量為7 000)，上海基星生物科技有限公司；MC3T3-E1胚胎成骨細胞，由蘇州大學基礎醫學與生物科學學院提供。

1.2 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的制備

剪碎的蠶繭經脫膠、溶解、透析等過程制得質量分數約為5%的蠶絲蛋白水溶液[13]，并置于4 ℃條件下保存待用。將明膠粉在60 ℃的蒸餾水中溶解，得到質量分數為20%的明膠水溶液。將制備的蠶絲蛋白水溶液與明膠水溶液按照一定的質量比(100∶0、70∶30、50∶50、30∶70和0∶100)混合，得到不同質量比的蠶絲蛋白/明膠復合水溶液。

采用自組裝的直寫擠出式3D打印設備在4 ℃環境下，將蠶絲蛋白/明膠復合水溶液通過打印噴頭打印到固定的表面皿上，打印出具有三維周期結構格柵狀蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠。打印噴頭采用內徑為0.9 mm的錐形注射器針頭。將打印好的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠置于-20 ℃下12 h后，放置在凍干機中48 h獲得凍干支架樣品[14]。

1.3 結構與性能測試

采用RS6000型流變儀(德國賽默飛世爾科技有限公司)測定蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的黏度、儲能模量(G′)和損耗模量(G″)等流變性能[15]。實驗使用的PP20H型平行板直徑為20 mm，平行板間距為0.5 mm，在頻率為1 Hz和溫度為4 ℃條件下進行掃描測試。

采用3365型電子萬能試驗機(美國英斯特朗公司)測定蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干支架的拉伸力學性能，并獲得相應的應力-應變曲線[16]。

采用Jasco-815型圓二色光譜儀(CD，日本分光株式會社)測定蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的二級結構，掃描波長范圍為250～190 nm，掃描速率為100 nm/min。

采用Nicolet5700型傅里葉紅外光譜儀(FT-IR，美國尼高力儀器公司)測試蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的紅外光譜圖，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

采用X′Pert-Pro MRD型X射線衍射儀(XRD，荷蘭帕納科公司)測試蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的衍射圖譜，掃描范圍為5°～45°。

采用S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM，日本日立公司)觀察凍干后的蠶絲蛋白/明膠格柵狀支架的結構。

采用MC3T3-E1胚胎成骨細胞培養來表征蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的生物相容性。將MC3T3-E1細胞分散于培養基內，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，觀察細胞的生長狀況，當細胞鋪滿瓶底80%時傳代使用。將格柵狀蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架高溫滅菌后，在支架上種植MC3T3-E1細胞，采用四唑鹽比色法(MTT)測定細胞在支架上的生長情況，借助掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長形貌[17]。

2 結果與討論

2.1 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的流變性能

圖1(a)示出蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠在4 ℃下的外觀形態。可見：純蠶絲蛋白呈溶液狀態，當蠶絲蛋白與明膠質量比為70∶30時，已呈現凝膠狀態；隨著明膠質量占比的提高，蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的凝膠效果越來越好，其對應的黏度測試結果如圖1(b)所示。可見，隨著明膠質量比的提高，蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的黏度逐漸增加，表明明膠的復合有利于提升蠶絲蛋白水溶液的凝膠成型效果。

圖1 不同質量比的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的外觀形貌和流變性能Fig.1 Morphology (a) and rheological property (b) of silk fibroin/gelatin blended hydrogel with different blended ratios

為進一步研究蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的凝膠成型性能，測試了它的儲能模量和損耗模量，結果如圖2所示。當儲能模量小于損耗模量時，流體表現為液體狀態；當儲能模量大于損耗模量時，流體表現為凝膠狀態[18]。由圖2(a)可見：純蠶絲蛋白體系的損耗模量大于儲能模量，體系呈現為溶液狀態，不利于3D打印快速凝膠成型；隨著明膠質量占比的增加，復合體系的儲能模量逐漸增大，儲能模量逐漸大于損耗模量，復合體系呈現膠體狀，且隨著明膠質量占比的增加，復合體系的膠體性能變好，有利于3D打印過程中的快速凝膠成型。

圖2 不同質量比的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的儲能模量和損耗模量Fig.2 Elastic shear and viscous moduli of silk fibroin/gelatin blended hydrogel with different blended ratio

2.2 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的力學性能

蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干支架的拉伸力學性能如圖3所示。可見：純蠶絲蛋白支架的斷裂強度較小，為0.87 MPa，斷裂伸長率為55.63%；隨著明膠質量占比的增加，復合水凝膠支架的斷裂強度逐漸增大，斷裂伸長率有一定程度的降低；當蠶絲蛋白與明膠質量比為50∶50時，復合水凝膠支架的斷裂強度為3.43 MPa，斷裂伸長率為45.64%。這可能是由于隨著復合水凝膠中明膠質量占比的提高，復合水凝膠的黏度和儲能模量逐步增加的緣故。另外，因蠶絲纖維在溶解過程中蛋白質大分子鏈被切斷，分子質量變小，導致明膠蛋白的分子質量高于蠶絲蛋白，也是導致隨著明膠復合比例的提高，復合水凝膠的斷裂強度逐漸提高的原因。

圖3 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的力學性能Fig.3 Mechanical property of silk fibroin/gelatin blended hydrogel

2.3 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的微觀結構

蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的圓二色光譜、紅外光譜和X射線衍射圖譜如圖4所示。由圖4(a)可見：蠶絲蛋白水溶液的圓二色光譜圖在195 nm處有吸收峰，屬于蠶絲蛋白silk I結構特征峰，表明其二級結構以無規卷曲為主[19]。蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠在197～198 nm處出現吸收峰，同屬于蠶絲蛋白silk I結構特征峰，表明蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的二級結構也是以無規卷曲為主，說明明膠的復合未對蠶絲蛋白的二級結構產生影響。

由圖4(b)可見：蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的紅外光譜在1 652～1 640 cm-1(酰胺I)和1 537 cm-1(酰胺II)處均有明顯的吸收峰，在1 237 cm-1(酰胺III)處有中等強度的吸收峰，表明蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的二級結構主要以無規卷曲為主[20]。此外，純蠶絲蛋白在酰胺I上的吸收峰在1 652 cm-1處，隨著明膠質量占比的增加，蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠酰胺I上的特征吸收峰向低波數偏移，且隨著明膠質量占比的提高，吸收峰向低波數方向偏移幅度變大；當蠶絲蛋白和明膠質量比為30∶70時，在酰胺I處出現2處特征吸收峰，分別在1 643和1 635 cm-1處，表明隨著明膠質量占比的增加，復合水凝膠體系的部分無規卷曲結構向β折疊結構轉變，這是由于蠶絲蛋白與明膠形成氫鍵所致[21]。

圖4 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的微觀結構圖Fig.4 Microstructure of silk fibroin/gelatin blended hydrogel.(a) Circular dichroism spectra; (b) FT-IR spectra; (c) XRD spectra

由圖4(c)可見：蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復合凝膠XRD圖譜均在20.6°附近出現比較寬的散射峰，沒有出現明顯的衍射峰。表明蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠的復合水凝膠均以無定形結構為主[22]，明膠對蠶絲蛋白的二級結構不產生影響，這與圓二色光譜和紅外光譜的分析結果是一致的。

2.4 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的形貌結構

3D打印蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠及其凍干后的支架形貌結構如圖5、6所示。由圖5可見：純蠶絲蛋白溶液體系通過打印針頭打印出后是溶液狀，不能成型；隨著明膠質量占比的增加，復合水凝膠的黏度增大，可成功打印出格柵狀蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠；當蠶絲蛋白與明膠質量比為50∶50時，可打印出成型較好、線條較規整的復合水凝膠。但隨著明膠質量占比的進一步增加，復合水凝膠的黏度進一步增大，不易從針頭擠出，成型效果變差(見圖5(d))；而純明膠水凝膠(見圖5(e))由于其黏度太大，不易從打印針頭擠出。將上述打印好的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠冷凍干燥，得到蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干支架，當蠶絲蛋白與明膠質量比為50∶50時，可得到成型效果較好、線條規整的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干支架(見圖6(c))；隨著明膠質量占比的進一步增大，凍干支架的成型效果變差。綜上所述，在3D打印蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠時，采用蠶絲蛋白與明膠的質量比為50∶50時較佳。

圖5 不同質量比的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架形貌Fig.5 Three-dimensional printing silk fibroin/gelatin blended hydrogels scaffolds with different blended ratios

經凍干后的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架的掃描電鏡照片如圖7所示。可見：蠶絲蛋白支架及蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架均呈現蜂窩狀的多孔結構，純蠶絲蛋白支架的多孔結構較為緊湊；蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干支架的孔隙尺寸逐步變大，說明明膠的復合在一定程度上改善了復合水凝膠體系的多孔結構，這對后續支架的細胞培養是有利的。

圖6 不同質量比的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干后支架形貌Fig.6 Three-dimensional printing silk fibroin/gelatin blended hydrogels freeze-dried scaffolds with different blended ratios

圖7 不同質量比的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠凍干支架SEM照片(×100)Fig.7 SEM images of freeze-dried silk fibroin/gelatin blended hydrogel scaffolds with different blended ratios(×100)

2.5 蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠細胞相容性

MC3T3-E1細胞在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠(50∶50)復合水凝膠支架上培養7 d后的細胞增殖情況如表1所示。可見，MC3T3-E1細胞在2種支架上均可較好地生長和增殖，這是因為蠶絲蛋白具有優異的生物相容性，且支架的多孔結構有利于細胞生長和增殖。細胞在蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架上的增殖情況要好于純蠶絲蛋白水凝膠支架。這是因為明膠的復合在一定程度上改善了支架的多孔結構，且明膠是一種活性蛋白[23]。細胞在2種支架上培養7 d后的生長情況如圖8所示。可見，培養7 d后，MC3T3-E1細胞以層狀覆蓋于支架的表面，細胞生長狀態良好，且細胞在復合水凝膠支架上已連成片狀，細胞生長、增殖和分化情況良好，這與MTT分析結果是一致的。上述結果表明，蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架具有良好的生物相容性。

表1 MC3T3-E1細胞在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架上的增殖情況Tab.1 Proliferation of MC3T3-E1 cell on silk fibroin and silk fibroin/gelatin scaffolds

圖8 MC3T3-E1細胞在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架上培養7 d后的掃描電鏡照片(×200)Fig.8 SEM images of MC3T3-E1 cell on silk fibroinscaffolds (a) and silk fibroin/gelatin scaffolds (b) after 7 days culturing(×200)

3 結 論

本文將蠶絲蛋白與明膠復合，通過明膠來調節蠶絲蛋白的快速凝膠成型，并通過直寫擠出式3D打印裝置制備了格柵狀蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠，研究了其結構與生物相容性，得出如下主要結論。

1)明膠的復合改善了蠶絲蛋白的流變性能，蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠的黏度隨著明膠質量比的增加而增加，其儲能模量大于損失模量，呈現凝膠狀態，有利于后續3D打印過程中的快速凝膠成型。當蠶絲蛋白與明膠質量比為50∶50時，可打印出成型較好、線條較規整的復合水凝膠；但隨著明膠質量占比的進一步提高，打印效果變差。凍干后的蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架呈現蜂窩狀的多孔結構。

2)蠶絲蛋白的二級結構以無規卷曲為主，明膠的復合對蠶絲蛋白的二級結構并未產生明顯的影響，但二者之間存在氫鍵結合，使得復合水凝膠的部分無規卷曲結構向β折疊結構轉變。明膠的復合提升了蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架的力學性能，且隨著明膠質量占比的增加，復合水凝膠支架的斷裂強度逐漸增加。

3)MC3T3-E1細胞可在蠶絲蛋白及蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架上生長和增殖，蠶絲蛋白/明膠復合水凝膠支架上增殖情況要好于純蠶絲蛋白支架；培養7 d后，MC3T3-E1細胞以層覆蓋于復合支架表面，細胞生長、增殖和分化情況良好。