二氧化硅包覆銀銅納米顆粒的結構及其抗菌性能

姜興茂， 劉 奇， 郭 琳

(武漢工程大學 化工與制藥學院， 湖北 武漢 430000)

近年來，人類大量使用抗生素，導致越來越多的細菌產生單一耐藥性甚至多重耐藥性。細菌耐藥成為人類健康的巨大威脅，若僅僅采用普通治療手段，細菌感染便會再次危害人類的生命安全，因此，尋找新的抗菌物質成為當前科研人員研究的一個熱點。金屬納米材料因具有大的比表面積和獨特的物理化學性質，使其在催化[1]、抗菌[2-3]等方面的應用前景廣受關注，一些具有抗菌能力的金屬納米粒子被研究人員相繼發現，如納米銀、納米銅等。

納米銀是常見的廣譜抗菌劑，擁有很好的生物相容性，可以抑制多種細菌生長，并且不產生耐藥性[4]。為了探索金屬納米顆粒對細菌的殺菌過程，人們開始研究金屬納米顆粒的殺菌機制，發現活性氧的生成和銀納米顆粒溶解釋放Ag+導致細菌死亡是當前普遍認同的抗菌機制[5-6]。銅是一種毒性較低的藥物，在抗菌治療中應用十分廣泛[7]。銅[8]、氧化銅[9-10]、氧化亞銅[11]均可用于抗菌。一些研究表明：和銀相比，銅對細菌生長的抑制作用更為顯著[12]。銅納米顆粒有多種殺菌機制，如：破壞細胞膜，損傷脫氧核糖核酸(DNA)，抑制蛋白質的合成及阻斷不同的生化途徑[13]。研究人員發現：與銅、銀納米顆粒相比較，銀銅雙金屬納米顆粒對細菌產生更強的抗菌活性。抗菌活性由強到弱依次為：銀銅雙金屬納米顆粒，銀納米顆粒，銀、銅納米顆粒混合，銅納米顆粒[14]。Perdikaki等[15]發現，對大腸桿菌而言，雙金屬Ag/Cu納米顆粒-石墨烯雜化物比Ag-石墨烯雜化物、Cu-石墨烯雜化物具有更好的抗菌性能，歸因于表面上2種不同金屬之間的協同作用。銀銅雙金屬納米顆粒卓越的抗菌活性得到研究人員廣泛的關注。由于金屬納米顆粒容易團聚導致抗菌性能減弱，因此采用無毒載體包裹[16]或負載[17]金屬納米粒子，避免金屬納米粒子聚集。載體的加入可以起到緩釋作用進而使抗菌劑達到長效抗菌的效果。

納米二氧化硅球具有較好的生物相容性且制備容易，因此，在生物醫藥領域一般使用二氧化硅作為載體。目前，人們通常采用兩步法制備二氧化硅負載單金屬納米顆粒[7,18]：第1步制備二氧化硅納米球；第2步將金屬納米顆粒沉積在二氧化硅納米球上。Isaacs等[19]采用反向微乳法制備了Ag/SiO2納米顆粒。上述材料制備方法均較為煩瑣，需要多步處理且只能負載1種金屬納米顆粒。氣溶膠法是將配制好的前驅體溶液通過霧化器霧化為氣溶膠小液滴，再由載氣送入管式爐內，液滴在管式爐內蒸發、結晶、干燥、分解反應、燒結并生成納米顆粒，最終得到納米粒子的一種方法。氣溶膠法是工業主導的納米粒子制備方法，具有可連續生產，擴大容易，純度高，顆粒球形度高，無需反復洗滌干燥，產品直接收集，環境友好等優點。

本文采用氣溶膠蒸發自組裝技術制備“火龍果”型高負載量Ag-Cu/SiO2納米顆粒。與單金屬Ag、Cu/SiO2納米顆粒的抗菌性能對比發現，雙金屬Ag-Cu/SiO2納米顆粒對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性的大腸桿菌均展現了更好的抗菌活性。同時，通過研究細菌胞內活性氧的變化，進一步探索了雙金屬納米顆粒的協同抗菌機制。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

硝酸銀(AgNO3，純度≥99.95%)、硝酸銅(Cu(NO3)2·3H2O)、無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，純度為99%)，武漢格奧化學技術有限公司；硝酸(含量為66%～68%)，武漢致遠天合化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨，生化試劑，北京雙旋微生物培養基制品廠；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA，純度≥97%)，阿拉丁試劑有限公司。

菌種：金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(S.aureus, ATCC9118)、大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli, CCTCC AB 93454)，均由武漢工程大學環境生態與生物工程學院提供。

1.2 實驗儀器

OTL-1200型高溫管式爐(南京博蘊通儀器科技有限公司)；2極1500X4型空氣壓縮機(臺州市奧突斯工貿有限公司)；SPH-200型氫氣發生器(北京中惠普分析技術研究所)；BDL-A3型氮氣機(石家莊邦力機電設備有限公司)；THZ-系列恒溫培養搖床(上海一恒科技有限公司)；722E型紫外可見分光光度計(天津市普瑞儀器有限公司)；F-7100 FL型熒光光譜儀(日本日立公司)。

1.3 Ag/SiO2、Cu/SiO2、Ag-Cu/SiO2的制備

以負載量50%雙金屬Ag-Cu/SiO2制備為例。

前驅體的制備：稱取0.926 9 g Cu(NO3)2·3H2O、0.651 1 g AgNO3溶解于25 mL去離子水中，其中Ag和Cu的量比為1∶1，攪拌使其完全溶解；以APTES為硅源，量取4.857 8 g APTES分散在12.66 mL無水乙醇中，將金屬鹽溶液與硅烷醇溶液混合均勻，之后向其中加入0.09 g硝酸，超聲振蕩5 min，然后使用磁力攪拌器攪拌，配制成為前驅體溶液。各原料APTES、 H2O、 EtOH 和 HNO3的量比為1∶63.3∶9.9∶0.044 。

采用氣溶膠法制備Ag-Cu/SiO2，實驗流程如圖1所示，以混合氣(氮氣與氫氣，載氣壓力為0.2 MPa)為載氣。首先，將前驅體溶液霧化成微小的氣溶膠液滴，由混合載氣將其送入600 ℃的管式爐中，氣溶膠液滴在其中經過蒸發、結晶、熱解、燒結/熔融等一系列過程，再在管式爐出口處通以大量氮氣進行冷卻、稀釋，生成固體粉末，最后由收樣器中的濾紙收集固體粉末，該產物就是負載量為50%的Ag-Cu/SiO2納米顆粒。

Ag/SiO2、Cu/SiO2的制備與其類似。稱取1.037 g AgNO3制備負載量為50%的Ag/SiO2，稱取2.491 g Cu(NO3)2·3H2O制備負載量為50%的Cu/SiO2。

圖1 采用氣溶膠法制備納米顆粒工藝流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of process flow for preparing nanoparticles by aerosol method

1.4 材料表征

所制備的樣品通過X射線粉末衍射儀(XRD，Bruker axs D8 Discover)進行表征，掃描范圍為5°～90°，Kα射線(波長為 0.154 056 nm)。使用FALCON60型能譜儀(EDS)測定樣品中各元素的質量分數。使用Tecnai G2 F20 S-TWIN TMP型透射電鏡(TEM)觀察樣品形貌。使用722E型可見分光光度計測定細菌懸浮液的吸光度(OD值)。使用F-7100 FL型熒光光譜儀測定細菌細胞內活性氧的熒光強度。

1.5 抗菌測試

通過測試所制備的負載量為50%的Ag/SiO2、Cu/SiO2、Ag-Cu/SiO2納米顆粒對S.aureus及E.coli的最低抑菌濃度(MIC)和時間-殺菌曲線來評價其抗菌性能。其中，滅菌處理后的牛肉膏蛋白胨培養基和營養瓊脂培養基用來培養所需的細菌。

1.5.1 最低抑菌濃度(MIC)的測定

通過常量稀釋法測定細菌的MIC值。首先將抗菌材料配制成1 mg/mL，之后將細菌接種于培養基中，接著在恒溫培養搖床(37 ℃)中培養16～20 h，把培養之后的細菌懸浮液用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋至108CFU/mL(通過分光光度計調節吸光度OD600為0.12左右)。首先向試管中加入培養基0.9 mL，再向試管中加入適當的PBS(PBS的量由加入抗菌材料的體積決定，保證溶液總體積為2 mL)，之后加入抗菌材料，接著向試管中滴加100 μL細菌懸浮液(保證細菌懸浮液細菌濃度為5×105CFU/mL左右)，最后在搖床中培養24 h。培養完成后觀察試管的渾濁度，細菌懸浮液不渾濁且透明時對應的抗菌材料最低濃度即為MIC值。實驗重復測試3次。

1.5.2 時間-殺菌曲線繪制

選取Ag-Cu/SiO2納米顆粒對S.aureus及E.coli的MIC值為抗菌濃度，研究Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2納米顆粒對細菌的時間-殺菌曲線。用PBS溶液稀釋細菌懸浮液，使菌液濃度約為108CFU/mL，向滅菌錐形瓶中加入牛肉膏蛋白胨培養基及PBS溶液，再向錐形瓶中分別加入40 μL抗菌材料(Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2)，加入5×105CFU/mL的細菌菌液，保證總體積為20 mL。未添加抗菌材料的為對照組。接著在37 ℃，200 r/min搖床內培養，取0、4、8、12、16、20、24 h時間點的少許菌液，測定細菌懸浮液的OD600值，并繪制時間-殺菌曲線，實驗重復測定3次。通過測定細菌懸浮液的OD值可以判斷細菌濃度，OD值越低，細菌含量越少。

1.5.3 細胞內活性氧(ROS)的測定

挑取單獨菌落于培養基中并在37 ℃搖床中培養16～20 h，用PBS稀釋至108CFU/mL，將負載量為50%的Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2加入到相同體積的菌液中，使材料質量濃度為2 μg/mL，未添加抗菌材料的細菌懸浮液為對照組。在37 ℃條件下培養6 h后，5 000 r/min離心5 min收集細菌細胞，并倒出上清液。將2, 7-二氯二氫熒光素二乙酸酯溶液(10 μmol/L DCFH-DA)加入到樣品管中，于37 ℃條件下培養20 min，倒出上清液并洗滌樣品3次，保證去除多余的DCFH-DA，以增強測試結果的準確性。使用熒光光譜儀測定樣品熒光強度(激發波長為450 nm，發射波長為535 nm)，實驗重復測定3次。通過測定細菌懸浮液的熒光強度來評價細菌胞內活性氧生成水平，由于細菌培養液的熒光強度與細菌細胞內ROS含量成正比，因此由熒光強度便可判斷細菌胞內ROS含量的高低。

2 結果與討論

2.1 二氧化硅包覆金屬顆粒的表征分析

圖2分別示出負載量為50%的Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的XRD圖譜。可知，這3種材料在2θ為23°處都有一個寬而大的峰，是SiO2標準特征峰，說明樣品中SiO2均是無定形的。圖2(a)為Ag-Cu/SiO2的XRD圖譜，可知樣品中存在單質銀特征峰(JCPDS 87-717 Ag)，分別對應立方晶系銀的(111)，(200)，(220)，(311)晶面。從XRD圖譜看不出單質Cu的特征峰，這是因為Cu被SiO2包覆使其3個主峰位特征峰不明顯，但不影響單質Ag特征峰的出現。圖2(b)為Ag/SiO2的XRD圖譜，樣品中存在單質銀特征峰(JCPDS 87-717 Ag)，且對應立方晶系銀的(111)，(200)，(220)，(311)晶面。圖2(c)為Cu/SiO2的XRD圖譜，圖譜中沒有觀察到Cu的特征峰，這是因為Cu被SiO2包覆使其特征峰不明顯。為了進一步說明樣品中存在相應的金屬元素，將上述3種樣品進行EDS表征。圖3分別示出負載量為50%的Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的EDS能譜圖。圖3(a)顯示，在Ag-Cu/SiO2中，含有銀銅2種金屬，說明Ag-Cu/SiO2納米顆粒制備成功。從圖3(b)看出Ag/SiO2中只含有銀，說明Ag/SiO2制備成功。從圖3(c)可以看到材料中含有銅元素，說明Cu/SiO2顆粒制備成功。

圖2 Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的XRD圖譜Fig.2 XRD pattern of Ag-Cu/SiO2 , Ag/SiO2 and Cu/SiO2

圖3 二氧化硅包覆金屬納米顆粒的EDS能譜圖Fig.3 EDS energy spectrum of silica-coated metal nanoparticles

對3種材料的形貌和金屬納米顆粒粒徑進行表征。圖4示出Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2納米顆粒的TEM照片?？煽闯?，這3種樣品均是SiO2球包覆金屬納米粒子的結構，金屬粒子分散較為均勻。圖5分別示出3種納米顆粒的粒徑分布圖。由圖可知：銀銅雙金屬納米顆粒平均粒徑約為11 nm；銀納米顆粒的平均粒徑為6.18 nm；銅納米顆粒的平均粒徑為3.31 nm?？梢姡晒χ苽涑鼍哂小盎瘕埞汀苯Y構的Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2納米顆粒。

圖4 二氧化硅包覆金屬納米顆粒的TEM照片Fig.4 TEM images of silica-coated metal nanoparticles

圖5 二氧化硅包覆金屬納米顆粒的粒徑分布圖Fig.5 Particle size distribution of silica-coated metal nanoparticles

2.2 抗菌活性對比

通過最低抑菌濃度(MIC)實驗，研究了Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2及SiO2納米顆粒對S.aureus和E.coli的抗菌活性。表1示出這幾種納米材料對S.aureus及E.coli的MIC值，其中Cu/SiO2及SiO2納米顆粒的MIC值均大于256 μg/mL，Ag/SiO2對S.aureus的MIC值為8 μg/mL，對E.coli的MIC值為4 μg/mL，Ag-Cu/SiO2對2種細菌的MIC值均為2 μg/mL。可知，雙金屬Ag-Cu/SiO2相比Cu/SiO2、Ag/SiO2及SiO2納米顆粒，展現了更強的抗菌活性，這是因為銀銅之間的協同效應使抗菌活性加強[15,20-21]。制備的Ag-Cu/SiO2雙金屬納米抗菌劑的抗菌活性比已經報道的其他雙金屬納米抗菌劑的抗菌活性要強[22-23]。

表1 不同二氧化硅包覆金屬納米顆粒對S.aureus和E.coli的最低抑菌濃度 μg/mL

圖6 Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2和Cu/SiO2對S.aureus和E.coli的時間-殺菌曲線Fig.6 Time-kill curves of S.aureus and E.coli treated with Ag-Cu/SiO2, Ag/SiO2 and Cu/SiO2

2.3 時間-殺菌曲線分析

通過檢測細菌懸浮液的吸光度(OD600)，繪制了Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2對S.aureus及E.coli的時間-殺菌曲線，如圖6所示。

從圖6(a)可以看出：對S.aureus而言，對照組和加入Cu/SiO2納米顆粒的培養液中細菌濃度在0～4 h增長緩慢，4～8 h急速增長，8～12 h放緩增長，12～24 h停止增長；加入Ag/SiO2納米顆粒的培養液，在0～4 h可以抑制細菌的生長，但之后細菌便快速增長；加入雙金屬納米顆粒Ag-Cu/SiO2的培養液，在24 h內細菌的含量很低，能夠充分抑制細菌的增長。從圖6(b)可以看出，對E.coli而言，對照組和加入Cu/SiO2納米顆粒的殺菌曲線趨勢基本一致，培養液中細菌在24 h內不斷生長；加入Ag/SiO2納米顆粒的培養液，在0～16 h能夠抑制細菌生長，細菌在20 h之后增長速度變快；加入雙金屬納米顆粒Ag-Cu/SiO2的培養液，在24 h內細菌的含量很低，能夠充分抑制細菌的增長。與Ag/SiO2和Cu/SiO2相比，Ag-Cu/SiO2在一定時間內能有效地抑制細菌增長，進一步驗證了雙金屬納米顆粒之間的協同抗菌效應。

2.4 殺菌機制分析

金屬納米顆粒的抗菌活性與細胞內活性氧(ROS)含量有關。DCFH-DA熒光探針是檢測胞內ROS水平的一種途徑，DCFH-DA探針進入細菌胞內，與酯酶作用后被水解生成二氯熒光黃素(DCFH)，最后不能通過細胞膜且無熒光的DCFH被ROS氧化為具有熒光的二氯熒光素(DCF)。表2示出不同二氧化硅包覆金屬納米顆粒對S.aureus和E.coli的相對熒光強度?？梢钥闯?，經過處理后S.aureus和E.coli的熒光強度有不同幅度的增強，說明細菌胞內活性氧含量不同程度的增多是因為Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的加入，其中Ag-Cu/SiO2>Ag/SiO2>Cu/SiO2。對S.aureus而言，加入Ag-Cu/SiO2后胞內活性氧的熒光強度是Ag/SiO2的1.79倍，是Cu/SiO2的2.89倍；對E.coli而言，加入Ag-Cu/SiO2后胞內活性氧的熒光強度是50% Ag/SiO2的1.09倍，是Cu/SiO2的1.77倍。研究表明，過量ROS會損傷生物大分子最終使細菌死亡[24]。結合金屬納米顆粒的抗菌活性結果發現，ROS含量與抗菌活性成正比。進一步的說明，Ag-Cu/SiO2中Ag、Cu之間產生了協同作用使ROS水平大幅增加，進而使其抗菌活性增強，因此認為Ag-Cu/SiO2使細菌胞內活性氧含量大幅增加，以致細菌死亡是銀銅雙金屬間協同抗菌作用表現形式之一，故Ag-Cu/SiO2產生大量ROS是該雙金屬納米材料的一種協同抗菌機制。

表2 不同二氧化硅包覆金屬納米顆粒對S.aureus和E.coli的相對熒光強度Tab.2 Relative fluorescence intensity of S. aureus and E.coli with different silica coated metal nanoparticles

3 結 論

本文采用氣溶膠一步法成功制備了“火龍果”型二氧化硅包覆銀銅雙金屬納米顆粒Ag-Cu/SiO2，并將其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抗菌性能及抗菌機制研究，得出以下主要結論。

1) Ag-Cu/SiO2是一種高負載量的強效抗菌劑，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有優良的抗菌效果，其最低抑菌濃度(MIC值)均為2 μg/mL，并且在24 h內可以充分抑制細菌生長。

2) 與單金屬納米顆粒Ag/SiO2和Cu/SiO2相比，雙金屬納米顆粒Ag-Cu/SiO2的抗菌活性更強，這是因為雙金屬之間的協同作用引起的。

3) 通過測量加入金屬納米顆粒之后細菌胞內活性氧的含量發現，納米顆?？咕鷦┑募尤胧够钚匝鹾坎煌潭鹊脑龆唷ＥcAg/SiO2、Cu/SiO2相比，Ag-Cu/SiO2的雙金屬之間的協同作用使胞內活性氧水平明顯增高，大量胞內活性氧會導致細菌死亡，從而使Ag-Cu/SiO2展現了更強的抗菌活性。