聚己內酯/聚乙二醇大孔徑納米纖維膜的制備及其在組織工程支架中的應用

潘 璐， 程亭亭， 徐 嵐,2

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 現代絲綢國家工程實驗室， 江蘇 蘇州 215123)

靜電紡納米纖維膜具有孔隙率高、比表面積大、生物相容性好等優點，在組織工程支架領域有著良好的應用前景。然而應用該技術制備的納米纖維膜通常孔徑小，易導致細胞生長受限，不利于營養物質傳輸和廢棄物排泄，從而影響其在組織工程支架方面的應用[1]；因此，采用靜電紡絲技術制備大孔徑納米纖維膜已成為該領域的研究熱點。

目前，大孔徑納米纖維膜常用的制備方法有溶劑燒鑄/顆粒浸出法[2]、改進接收裝置法[3]、微納米纖維沉積法[4]，物理修飾法[5]和調整紡絲參數法[6]。Nam等[2]使用同軸靜電紡絲裝置將NaCl顆粒附著在納米纖維表層，然后用去離子水沖洗去除NaCl顆粒，最終得到多孔的納米纖維支架；Blakeney等[7]將不銹鋼探針嵌入接地的半球形圓盤中作為接收裝置，成功制備了大孔徑的靜電紡納米纖維支架；Shim等[8]將制備好的殼聚糖納米纖維作為接收板，采用靜電紡絲法制備了納米-微米復合纖維膜；Gu等[9]利用超聲處理靜電紡絲技術制備了殼聚糖納米纖維膜，改變了納米纖維膜的孔徑和厚度；Cheng等[10]設計開發了一種使用銅網作為接收裝置，且其后放置有吹風裝置的改進靜電紡絲裝置，并采用此裝置成功制備了大孔徑聚乙烯醇納米纖維膜。

然而，Cheng等[10]在實驗中采用的聚乙烯醇生物相容性較差，不利于其在組織工程中的應用。聚己內酯因其良好的生物降解性、藥物透過性、生物相容性、原料易得，以及不會對人體產生毒副作用，可提高藥物的穩定性等優點，被廣泛應用于組織工程領域；但聚己內酯的結晶性很強，親水性較差，屬于疏水性材料，作為組織工程材料時不利于細胞的黏附。聚乙二醇的分子中存在大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，具有良好的親水性，且其分子鏈兩端的羥基有較好的反應性，可與很多化合物產生反應，用于修飾聚合物。故可將其與其他高分子聚合物共混，降低高分子材料的結晶度，增加材料的親水性[11]。

綜合以上分析，本文采用改進的靜電紡絲裝置[10]制備了PLC/PEG大孔徑復合納米纖維膜，研究了紡絲溶液溶質質量配比及其質量分數對復合納米纖維膜形貌及其性能的影響，確定了最佳工藝參數，并探究了該大孔徑纖維膜在組織工程中應用的可能性。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

聚己內酯(PCL，相對分子質量為80 000)，上海源葉生物科技有限公司；聚乙二醇(PEG，相對分子質量為2 000)，國藥集團化學試劑蘇州有限公司；四氫呋喃(THF)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；無水乙醇(分析純)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；高糖完全培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素&鏈霉素(雙抗型)、胰蛋白酶(EDTA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，蘇州明德生物科技有限公司；二甲基亞砜(細胞培養級，DMSO)、戊二醛固定液(電鏡專用，質量分數為2.5%)、噻唑蘭(MTT)，蘇州科創生物技術有限公司；丙酮，分析純，蘇州大學實驗材料供應中心；人臍靜脈內皮細胞(EC)，蘇州大學醫學院。

1.2 實驗儀器

ISP01-A型恒流注射泵，保定蘭格恒流泵有限公司；DW-P403-1ACCC型高壓電源，天津東文高壓電器有限公司；靜電紡絲接收裝置，實驗室自制；S-4800型冷場發射掃描電鏡，日本日立公司；INSTRON-3365型萬能材料試驗機，美國INSTRON公司；BPN-80CH(UV)型CO2培養箱，蘇州凱茵生物科技有限公司；Synergy HT型全自動酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；3524型24孔板、3599型96孔板，美國康寧公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紡絲溶液的配制

稱取一定質量的PCL顆粒和PEG片狀物加入到質量比為5∶1的四氫呋喃和無水乙醇混合溶液中，在室溫下磁力攪拌至均一澄清配制紡絲液；按照該方法配制PCL和PEG紡絲液質量分數為25%，其中PCL和PEG的質量比分別為30∶70、50∶50、70∶30、80∶20、90∶10。確定PCL和PEG的最佳質量配比后，使用最佳質量配比，按上述方法繼續配制質量分數分別為15%、20%、25%、30%的紡絲液，以確定最佳紡絲液質量分數。

1.3.2 大孔徑納米纖維膜的制備

改進靜電紡絲裝置如圖1所示。

圖1 改進的靜電紡絲裝置原理圖Fig.1 Schematic of modified electrospinning device

該裝置使用銅網作為接收裝置，且其后放置有吹風裝置。采用此裝置制備PCL/PEG大孔徑復合納米纖維膜。根據文獻[10]中的最佳紡絲參數，設定接收銅網網孔尺寸為4 mm×4 mm，風速為5 m/s，紡絲電壓為12 kV，紡絲距離為18 cm，紡絲速度為1.0 mL/h。

1.3.3 細胞培養

將納米纖維膜在紫外燈照射下殺菌4 h后，剪成1 cm×1 cm大小，放入乙醇溶液中浸泡1 h，然后用PBS沖洗3次后置于DMEM培養基中浸泡12 h，于室溫下干燥備用。

取凍存人臍靜脈內皮細胞(EC)復蘇，置于CO2含量為5%和溫度為37 ℃的培養箱中培養，觀察細胞生長狀態，待細胞增殖覆蓋培養瓶的90%時開始傳代。取生長狀況良好的第3代，用EDTA酶消化細胞后，調整細胞濃度為1×105個/mL，按照每孔1 mL細胞溶液的要求將細胞分別接種于空白24孔細胞培養板、大孔徑納米纖維膜和對照樣(傳統靜電紡納米纖維膜)上，每組設置3個平行樣，放入培養箱(5% CO2，37 ℃)中培養，每隔1～2 d更換1次培養基。

1.4 測試與表征

1.4.1 纖維膜表面形貌觀察及纖維直徑測試

在25 ℃條件下對樣品進行表面噴金處理，采用掃描電鏡觀察纖維膜的表面形貌。使用Image J軟件分析纖維的掃描電鏡照片，每個樣品中纖維直徑均隨機測量100次，計算平均值和直徑分布。

1.4.2 納米纖維膜的力學性能測試

將纖維膜制成長40 mm、寬10 mm的樣品后，置于溫度為20 ℃，相對濕度為65%的恒溫恒濕室預調濕24 h以達到平衡回潮率。采用萬能材料試驗機對制備的纖維膜樣品進行力學性能測試。試樣的加持長度為20 mm，拉伸速度為20 mm/min，每組樣品測試5次，取平均值。

1.4.3 納米纖維膜的孔徑測試

選擇不同紡絲條件下制備的納米纖維膜樣品的相同倍數掃描電鏡照片，使用Image J軟件測量其孔徑，每個樣品各選10張，用Excel和OriginPro8.5計算纖維膜孔徑的平均值及其分布。

1.4.4 納米纖維膜的細胞相容性測試

采用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)比色法表征細胞的黏附情況和增殖能力。在24孔板中的納米纖維膜上種植細胞后，分別在細胞培養了1、3、6、12 h和1、3、5、7 d時，向孔板每孔內加入200 μL的MTT溶液，置于CO2培養箱中孵化4 h后，轉移至新的24孔板中并加入400 μL的DMSO搖晃10 min；再將混合后的溶液轉移至96孔板中，每孔100 μL，同時設置DMSO的空白對照；最后將96孔板置于酶標儀中測定溶液吸光度值，選定波長為570 nm。根據測試的各樣品的吸光度值分析細胞的黏附和增殖情況。

1.4.5 細胞生長的形貌觀察

將細胞置于CO2含量為5%和溫度為37 ℃的培養箱中培養，培養1、3、5、7 d后取出樣品，用PBS沖洗3次后，用戊二醛溶液將纖維膜上的細胞固定，置于4 ℃的冰箱中靜置一晚后取出，再用PBS沖洗3次；然后用質量分數為25%、50%、75%、90%和100%的乙醇梯度脫水各5 min；最后干燥樣品，噴金90 s后于冷場發射掃描電鏡下觀察細胞的生長情況。

2 結果與討論

2.1 溶質配比對納米纖維膜性能的影響

2.1.1 形貌與直徑分析

圖2為不同PCL和PEG質量比的PCL/PEG納米纖維膜的掃描電鏡照片。

圖2 不同PEG和PCL質量比納米纖維膜掃描電鏡照片(×10 000)Fig.2 SEM images of nanofiber membranes with different mass ratios of PEG and PCL(×10 000)

由圖2可知：當PCL和PEG的質量比為30∶70、50∶50和70∶30時，纖維上均有串珠產生，且隨著質量比的增加呈減少趨勢；當二者質量比為80∶20和90∶10時，纖維上串珠消失，PCL/PEG納米纖維的表面光滑且平直。這是因為PCL的相對分子質量比PEG大得多，因此，隨著PCL占比的增大，PCL分子鏈形成的無規線團體積增大且纏結充分，導致大分子運動時內摩擦阻力增大，紡絲溶液的黏度增大[12]。當溶液黏度較小時，其可紡性較差[12]，纖維上易有串珠生成。隨著溶液黏度增大，溶液可紡性變好，纖維的形貌也隨之變好，當溶液黏度過大時，紡絲針頭易堵塞，紡絲過程不穩定。

表1示出固定溶液質量分數情況下不同PEG和PCL質量比的PCL/PEG納米纖維膜的直徑統計結果。可知，當溶液質量分數不變時，PCL/PEG納米纖維的平均直徑隨著PCL占比的增加而增大，且直徑分布的均勻性也越來越差。這是由于PCL占比增多使得溶液黏度增大，從而導致纖維平均直徑增大[12]。此外，當紡絲溶液黏度較大時，紡絲針頭易發生堵塞，影響了紡絲過程的穩定性，從而導致纖維直徑分布性越來越差。

表1 不同PEG和PCL質量比納米纖維膜的直徑統計結果Tab.1 Diameter statistics of nanofibers with different mass ratios of PEG and PCL

2.1.2 力學性能分析

表2示出不同PCL和PEG質量比的PCL/PEG納米纖維膜的斷裂強度和斷裂伸長率。可知，隨著PCL占比增加，PCL/PEG納米纖維膜的斷裂強度和斷裂伸長率均呈增加趨勢，斷裂強度由0.62 MPa增加到3.71 MPa，斷裂伸長率由25.13%增加至92.43%，表明PCL/PEG納米纖維膜的力學性能隨著PCL占比的增加而增強。這是因為隨著PEG占比的增加，PEG分散相將以液滴形式存在于PCL連續相中，極大影響了紡絲過程的穩定性和纖維成形的連續性，破壞了纖維的成絲均一性，因此，隨著單軸抗拉強度較大的PCL的占比增加[13]，以液滴形式存在的PEG分散相質量分數隨之減少，紡絲溶液的黏度增加，可紡性變好，紡絲過程穩定，纖維形貌結構變好，無串珠生成，降低了弱環效應的影響，且纖維直徑也隨之增加，從而導致纖維膜的強度增加，且PCL納米纖維膜對比PEG納米纖維膜具有更好的柔韌性。

綜上可知，當PCL和PEG的質量比為80∶20時，PCL/PEG納米纖維膜的形貌較好，且纖維的平均直徑較小，分布較均勻，力學性能也較好，故確定以80∶20質量比的PCL/PEG納米纖維膜進行下一步實驗分析。

表2 不同PCL和PEG質量比納米纖維膜的力學性能Tab.2 Mechanical properties of nanofiber membranes with different mass ratios of PEG and PCL

2.2 紡絲溶液質量分數對纖維膜性能影響

2.2.1 對形貌結構和直徑的影響

圖3示出不同質量分數紡絲溶液制備的PCL/PEG納米纖維膜的掃描電鏡照片。可知：當紡絲溶液質量分數為15%和20%時，纖維上有微球產生，這是因為溶液質量分數較小時，其黏度也較低，可紡性差，溶劑快速揮發造成紡絲射流無法在外加電場的作用下被充分拉伸，故形成微球[14]；當質量分數為25%時，PCL/PEG納米纖維膜的形貌光滑、平直，無微球出現；但當溶液質量分數增加到30%時，納米纖維出現彎曲、表面不光滑，且有串珠出現，這可能是由于溶液質量分數過大，導致溶液黏度過大，可紡性差造成的。此外，當溶液質量分數為30%時，溶液黏度過大，流動性差，易凝結造成針頭的阻塞，從而影響紡絲的持續進行。

圖3 不同PCL/PEG質量分數納米纖維的形貌(×10 000)Fig.3 Morphology of nanofibers with different PCL/PEG concentrations(×10 000)

表3為PCL和PEG質量比為80∶20時不同紡絲液質量分數下PCL/PEG納米纖維的直徑分布情況。

由表3可知，當PCL和PEG的質量配比不變時，納米纖維的平均直徑隨著溶液質量分數的增加而增大，這主要是因為聚合物質量分數增加，使得紡絲溶液的黏度增加，從而導致纖維直徑增加。

表3 不同PCL/PEG質量分數納米纖維的直徑統計結果Tab.3 Diameter statistics of nanofibers with different PCL/PEG mass fractions

2.2.2 對力學性能的影響

表4示出不同質量分數紡絲溶液制備的PCL/PEG納米纖維膜的斷裂強度和斷裂伸長率測試結果。可知，隨著紡絲溶液質量分數的增加，PCL/PEG納米纖維膜的斷裂強度和斷裂伸長率均呈增加的趨勢。這是由于當溶液質量分數較低時，溶液黏度也較低，分子鏈相互纏結不充分，且纖維呈串珠狀纖維結構，導致纖維膜力學性能較差；隨著溶液質量分數的增加，溶液的黏度增加，大分子鏈之間纏結充分，可紡性變好，纖維形貌結構變好，從而使得纖維膜的斷裂強度增加，斷裂伸長率增加。

表4 不同PCL/PEG質量分數納米纖維膜的力學性能Tab.4 Mechanical properties of nanofiber membranes with different PCL/PEG mass fractions

綜上可知，當溶液質量分數為25%時，納米纖維膜的形貌最好，且力學性能也較好，因此，選擇溶液質量分數為25%進行下一步分析。

2.3 細胞在纖維膜上的黏附與增殖

圖4示出在PCL和PEG的混紡質量比為80∶20，紡絲液質量分數為25%條件下制備的傳統靜電紡納米纖維膜和改進靜電紡納米纖維膜的掃描電鏡照片。表5示出2種方法制備的納米纖維膜的平均孔徑測試結果。可知，改進的靜電紡絲方法制備的納米纖維膜的孔面積較傳統靜電紡絲方法制備的納米纖維膜的孔面積大。

圖5示出人臍靜脈內皮細胞在2種纖維膜及空白培養板上的黏附和增殖情況。從圖5(a)可看出：在培養12 h內，細胞黏附在2種纖維膜和空白培養板上，且隨著時間的延長，黏附細胞的數量略有增加；前6 h內細胞大都已經黏附在納米纖維膜和空白培養板上，在后6 h吸光度值的變化不大，且改進靜電紡制備的大孔徑納米纖維膜上細胞的黏附情況較傳統靜電紡納米纖維膜的好。這是因為大孔徑納米纖維膜的孔徑大，更利于細胞的黏附。

圖4 傳統和改進靜電紡PCL/PEG納米纖維膜的掃描電鏡照片(×2 000)Fig.4 SEM images of traditional (a) and modified (b) electrospinning PCL/PEG membranes(×2 000)

表5 傳統和改進靜電紡PCL/PEG納米纖維膜的孔面積統計結果Tab.5 Pore size statistics of traditional and modified electrospinning PCL/PEG membranes

由圖5(b)可知：在細胞培養7 d的過程中，2種纖維膜上培養的細胞數量整體均呈增加趨勢；培養1 d時，吸光度值沒有顯著性差異；培養3 d時細胞增殖逐漸加快，培養5 d時急劇增加，而至培養7 d時增殖又變得緩慢。此外，還可明顯看出，培養1 d時2種纖維膜的吸光度值幾乎相同，培養3 d時改進靜電紡納米纖維膜的吸光度值略高于傳統的靜電紡納米纖維膜，而在培養5和7 d時，改進靜電紡大孔徑納米纖維膜的吸光度值明顯高于傳統靜電紡納米纖維膜。這表明改進的靜電紡大孔徑納米纖維膜上的細胞增殖較傳統的靜電紡納米纖維膜快，且細胞數量多，說明大孔徑納米纖維膜更易于細胞的生長與增殖。

圖6為人臍靜脈內皮細胞在傳統和改進靜電紡納米纖維膜上分別培養1、3、5、7 d的掃描電鏡照片。可見：隨著培養天數的增加，細胞數量增加，且培養3～5 d時，細胞增殖較快。此外，改進的靜電紡大孔徑納米纖維膜上培養的細胞的增殖情況和生長情況較傳統靜電紡納米纖維膜更好；培養7 d時，人臍靜脈內皮細胞呈片狀覆蓋在傳統靜電紡納米纖維膜上，而改進的靜電紡大孔徑納米纖維膜的表面幾乎完全被細胞覆蓋。該結果進一步說明了PCL/PEG納米纖維膜對細胞無毒，細胞可在其上獲得良好的生長，并表明改進的靜電紡絲裝置制備的大孔徑PCL/PEG納米纖維膜更有利于細胞的生長和增殖。

圖6 培養不同時間時人臍靜脈內皮細胞在傳統和改進的納米纖維膜上的掃描電鏡照片(×600)Fig.6 SEM images of EC cultured on traditional(a)and improved(b)nanofiber membranes at different times(×600)

3 結 論

1)PCL和PEG質量比及質量分數的不同均使得PCL/PEG納米纖維膜具有不同的形貌和性能。當PCL和PEG的質量比為80∶20，紡絲溶液質量分數為25%時，納米纖維膜的形貌較好，纖維直徑較小且直徑分布相對均勻，力學性能也較好。

2)改進的靜電紡絲方法制備的PCL/PEG納米纖維膜的孔面積較傳統靜電紡絲納米纖維膜的大，其平均孔面積由9.00 μm2提高到了15.22 μm2。

3)人臍靜脈內皮細胞在傳統和改進的靜電紡納米纖維膜上的黏附和增殖情況表明PCL/PEG納米纖維膜對細胞無毒，具有良好的細胞相容性，且改進靜電紡絲裝置制備的大孔徑PCL/PEG納米纖維膜更有利于細胞的生長和增殖，更適合應用于組織工程支架。